尹 婕，何志昂，張 毅，王麗萍

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心 鄭州 450052 3)河南省腫瘤免疫與生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康[1]，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌的85%[2]。雖然目前治療手段不斷提高，但由于多數(shù)NSCLC患者發(fā)現(xiàn)較晚且出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差,因此亟待探索影響患者預(yù)后的相關(guān)因素。隨著對腫瘤免疫微環(huán)境研究的不斷深入，影響腫瘤細(xì)胞生長、進(jìn)展以及侵襲性的多種機(jī)制和途徑逐漸被揭示[3]。目前研究[4-5]發(fā)現(xiàn)表達(dá)叉頭框蛋白3(forkhead box protein 3, Foxp3)和程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1, PD-1)等免疫抑制標(biāo)志物的細(xì)胞在腫瘤逃逸機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Foxp3被認(rèn)為是調(diào)控T細(xì)胞分化和功能的關(guān)鍵因子；研究[6-7]表明，F(xiàn)oxp3與NSCLC患者不良預(yù)后有關(guān)。PD-1是一種重要的免疫抑制因子，其表達(dá)與CD8+T細(xì)胞的功能障礙有關(guān)，可造成T細(xì)胞耗竭[8-9]；已證明[10]PD-1抑制劑可治療部分NSCLC患者，且療效顯著。CD45分子又稱白細(xì)胞共同抗原，在淋巴細(xì)胞的發(fā)育成熟、功能調(diào)節(jié)及信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，其亞型由3種不同的外顯子(A、B和C)選擇性鏈接而成，其中缺乏3個(gè)外顯子的亞型稱為CD45RO，是區(qū)分原始T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞的重要標(biāo)志[11]。有研究[12]表明，肺癌患者腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞CD45RO多為高表達(dá)，但其與患者預(yù)后的關(guān)系有待探討。本研究觀察了NSCLC患者腫瘤組織中免疫抑制標(biāo)志物Foxp3、PD-1和記憶性T細(xì)胞標(biāo)志物CD45RO的表達(dá)情況，并探討三者的表達(dá)與臨床病理因素及患者預(yù)后的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2009年9月至2010年8月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科收治的87例NSCLC手術(shù)患者的腫瘤組織。男67例，女20例，其中57(65.5%)例有吸煙史。年齡37～83歲，中位年齡60歲。48例為鱗狀細(xì)胞癌(簡稱鱗癌)，39例為腺癌；73例患者腫瘤直徑>5 cm，14例≤5 cm；47例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；高、中、低分化依次為9、67和11例；TNMⅠ、Ⅱ、Ⅲ期分別為11、32、44例。另外收集18例NSCLC手術(shù)患者的癌旁正常組織(距癌組織≥5 cm且經(jīng)病理證實(shí))和20例良性病變患者切除的正常肺組織作為對照。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有組織均經(jīng)過患者知情同意后收集，并且經(jīng)過病理醫(yī)師再次審閱并明確診斷。

1.2不同組織中PD-1、Foxp3和CD45RO蛋白表達(dá)的檢測鼠抗人PD-1、鼠抗人CD45RO單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，使用時(shí)均按1∶100稀釋，鼠抗人Foxp3單克隆抗體購自美國BD公司，使用時(shí)按1∶50稀釋，免疫組化試劑盒購自美國Thermo Scientific公司。取石蠟包埋組織，4～5 μm厚切片，采用免疫組化SP法分別檢測PD-1、Foxp3和CD45RO的表達(dá)情況，以已知陽性切片為陽性對照，以PBS代替一抗為陰性對照，具體操作方法參照試劑盒說明。采用Olympus光學(xué)顯微鏡和計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)采集圖像，選擇組織結(jié)構(gòu)清晰且染色均勻的切片進(jìn)行定量分析。PD-1、Foxp3和CD45RO陽性顯色均為棕黃色顆粒，PD-1主要在胞質(zhì)和胞膜中表達(dá)，F(xiàn)oxp3和CD45RO在核仁、胞質(zhì)和胞膜中均有表達(dá)。由兩名研究人員分別選擇5個(gè)獨(dú)立視野(×400)進(jìn)行雙盲閱片。計(jì)算陽性細(xì)胞百分比。陽性細(xì)胞百分比<1%為0分，1%～為1分，11%～為2分，>50%為3分；染色強(qiáng)度：無染色為0分，弱染色為1分，中度染色為2分，強(qiáng)染色為3分。最終將兩項(xiàng)評分相乘得到免疫反應(yīng)評分，>5分為高表達(dá)，<5分為低表達(dá)[13]。

1.3隨訪87例NSCLC患者均獲隨訪，開始隨訪時(shí)間為2009年10月，末次隨訪時(shí)間為2013年12月，隨訪終點(diǎn)為患者術(shù)后出現(xiàn)疾病進(jìn)展或死亡，無進(jìn)展生存期(progression-free survival, PFS)定義為患者自接受手術(shù)開始到出現(xiàn)明確疾病進(jìn)展的時(shí)間。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)。采用χ2檢驗(yàn)比較不同臨床病理因素的NSCLC組織中上述3種蛋白表達(dá)的差異。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1NSCLC組織與對照組織中PD-1、Foxp3和CD45RO的表達(dá)在腫瘤組織和對照組織中，CD45RO的表達(dá)水平相似，而 PD-1和Foxp3則在腫瘤組織中高表達(dá)，見圖1和表1。

A:PD-1的表達(dá);B:CD45RO的表達(dá);C：Foxp3的表達(dá);1：低表達(dá)；2：高表達(dá)

表1 不同組織中3種蛋白表達(dá)的比較 例(%)

*:校正χ2檢驗(yàn)

2.2Foxp3、PD-1及CD45RO的表達(dá)與NSCLC臨床病理因素的關(guān)系CD45RO幾乎在所有腫瘤組織和對照組織中均有表達(dá)，其在腫瘤組織中的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，F(xiàn)oxp3高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)，PD-1高表達(dá)與各臨床病理因素均無關(guān)(表2)。

表2 不同臨床病理特征NSCLC腫瘤組織中Foxp3、PD-1及CD45RO表達(dá)的比較

續(xù)表2

2.3不同F(xiàn)oxp3、PD-1和CD45RO表達(dá)水平的NSCLC患者的生存分析患者無進(jìn)展生存曲線見圖2，可見Foxp3高表達(dá)的患者預(yù)后較差(χ2=4.320，P=0.042)。

圖2 不同F(xiàn)oxp3(左)、PD-1(中)和CD45RO(右)表達(dá)水平患者的生存曲線

3 討論

本研究結(jié)果顯示，PD-1和Foxp3在NSCLC組織中高表達(dá)，提示二者可能參與NSCLC的發(fā)生。Fu等[14]的研究認(rèn)為Foxp3的表達(dá)與NSCLC患者TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和低分化組織中Foxp3高表達(dá)率更高，且Foxp3高表達(dá)的患者預(yù)后更差。有報(bào)道[15]表明在其他惡性腫瘤如人乳頭瘤病毒相關(guān)的頭頸癌中，PD-1陽性表達(dá)者較陰性表達(dá)者具有更好的預(yù)后，在濾泡性淋巴瘤中亦有類似結(jié)果[16]。但與預(yù)期不同的是，本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC組織中PD-1高表達(dá)與患者的臨床病理參數(shù)和無進(jìn)展生存期無關(guān)，推測可能是由于本項(xiàng)目收集的樣本量相對較少，下一步擬繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證。

此外，本研究還觀察了記憶性T細(xì)胞標(biāo)志物CD45RO的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在NSCLC組織和正常組織中的高表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者腫瘤組織中高表達(dá)。在其他腫瘤中，Chen等[17]則證明CD45RO陽性與結(jié)直腸癌患者的生存正相關(guān)，譚莉霞等[18]亦有相同發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，F(xiàn)oxp3和PD-1在NSCLC組織中高表達(dá)；Foxp3在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度低的NSCLC組織中高表達(dá)，且與患者不良預(yù)后有關(guān)；PD-1表達(dá)與患者的臨床病理參數(shù)和PFS尚未證明有明顯相關(guān)性；CD45RO表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，但與患者的其他臨床病理參數(shù)和預(yù)后無關(guān)。