馬明逸，余 列，秦 波

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 鄭州 450052

抑郁癥又稱為抑郁障礙，是精神科十分常見的疾病，全世界約3.22億患者，且患者人數(shù)在逐年增加[1-3]。因該類患者勞動(dòng)力減弱且需長(zhǎng)期或終身服藥，給個(gè)人、家庭及社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[4],但目前的治療手段不多且療效欠佳。近期的研究[5-6]提示，以Th17細(xì)胞增多為特征的免疫系統(tǒng)紊亂可能是抑郁癥的重要發(fā)病機(jī)制。因此，抑制Th17細(xì)胞形成逐漸成為抗抑郁的研究熱點(diǎn)。Th17細(xì)胞來源于初始CD4+T細(xì)胞，以分泌IL-17A為特征。研究[5]發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞分化形成及功能執(zhí)行過程中的代謝模式偏好于糖酵解。抑制初始CD4+T細(xì)胞的糖酵解能有效減少Th17細(xì)胞的形成[7]。鳶尾素是于2012年被發(fā)現(xiàn)的一種運(yùn)動(dòng)激素，通過調(diào)控細(xì)胞代謝發(fā)揮生理學(xué)作用，參與多種病理生理過程[8]。目前的研究主要探討了鳶尾素對(duì)肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元等細(xì)胞功能的影響[8-10]，尚無研究探討其對(duì)免疫系統(tǒng)是否具有調(diào)節(jié)作用。本研究觀察了鳶尾素對(duì)抑郁小鼠CD4+T細(xì)胞糖酵解和Th17分化的影響，探討其是否可通過調(diào)控CD4+T細(xì)胞的代謝，抑制Th17細(xì)胞的形成，發(fā)揮抗抑郁作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器兔抗小鼠丙酮酸激酶2(pyruvate kinase subtype M2,PKM2)多克隆抗體購自美國(guó)Abcam公司，CD4-PerCP、CD62L-APC、CD44-FITC、CD25-PE、IL-17A-APC抗體購自德國(guó)美天膩公司，CD3、CD28、IL-4、IFN-γ抗體購自美國(guó)BD公司。淋巴細(xì)胞分離液、乳酸含量測(cè)定試劑盒及丙酮酸含量測(cè)定試劑盒購自北京索萊寶公司。IL-17A ELISA 檢測(cè)試劑盒，IL-6、TGF-β1、IL-1β、IL-23及重組鳶尾素蛋白購自美國(guó)R&D公司。曠場(chǎng)行為檢測(cè)系統(tǒng)購自上海贊德公司，強(qiáng)迫游泳裝置購自江蘇塞昂斯公司，F(xiàn)ACSCelesta流式細(xì)胞儀購自美國(guó)BD公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物10～12周齡BALB/c雄性小鼠購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SYXK(豫)2011-0001。單籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度(22±1) ℃，濕度(55±5)%，12 h/12 h晝夜節(jié)律，自由攝食飲水。

1.3抑郁模型的制備及實(shí)驗(yàn)分組將小鼠按照20 mg/(kg/d)的劑量腹腔注射皮質(zhì)醇，4周后采用糖水偏好實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)抑郁模型是否成功[6]。將造模成功的小鼠分為2組，模型組和鳶尾素組，每組6只。正常對(duì)照組小鼠6只不造模。鳶尾素組小鼠按照100 μg/kg腹腔注射重組鳶尾素，正常對(duì)照組和模型組注射等體積的生理鹽水[8]，連續(xù)6 d。

1.4小鼠抑郁行為的觀察

1.4.1 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 于末次腹腔注射皮質(zhì)醇后第2天進(jìn)行。在籠子的左右角分別放置10 g/L蔗糖水1瓶和純水1瓶，1 h后測(cè)量2瓶液體質(zhì)量變化。糖水偏好度=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。

1.4.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 糖水偏好實(shí)驗(yàn)完成后隔天進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。測(cè)試箱的規(guī)格為50 cm×50 cm×40 cm，底部黑色，四壁白色。將小鼠面朝箱壁放入測(cè)試箱內(nèi)的某一角落，采集小鼠10 min內(nèi)曠場(chǎng)中心區(qū)的運(yùn)動(dòng)時(shí)間及進(jìn)入中心區(qū)的次數(shù)。實(shí)驗(yàn)完畢后，清理測(cè)試箱，乙醇消毒、通風(fēng)后進(jìn)行下只小鼠的測(cè)試。每只小鼠實(shí)驗(yàn)1次。

1.4.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)完成后進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。向玻璃圓缸內(nèi)加入25 ℃左右的純凈水至20 cm刻度。放入小鼠后使用系統(tǒng)自帶視頻采集軟件采集小鼠活動(dòng)影像6 min，記錄后4 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。完成實(shí)驗(yàn)后，更換測(cè)試器內(nèi)溫水后進(jìn)行下只小鼠的測(cè)試。每只小鼠實(shí)驗(yàn)1次。

1.5小鼠外周血中Th17細(xì)胞比例及IL-17A含量的測(cè)定

1.5.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞的收集 所有行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完成后，小鼠眼眶靜脈采血1～2 mL，抗凝，加入等體積的RPMI 1640培養(yǎng)基充分混勻，加2 mL淋巴細(xì)胞分離液1 500 r/min離心15 min，收集白膜層后用PBS清洗2次，1 800 r/min 離心10 min，收集沉淀(單個(gè)核細(xì)胞)備用。

1.5.2 指標(biāo)檢測(cè) ①Th17細(xì)胞比例：取含有106個(gè)細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞懸液，加入PBS并定容至100 μL，分別加入CD4和IL-17A抗體，充分混勻后，4 ℃避光保存45 min；加入1 mL PBS，2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL PBS后上流式儀檢測(cè)CD4+IL-17A+細(xì)胞比例。②IL-17A含量：收集小鼠外周血，按照檢測(cè)試劑盒說明書操作，檢測(cè)外周血中IL-17A的含量。

1.6鳶尾素處理后小鼠初始CD4+T細(xì)胞Th17分化及糖酵解的變化

1.6.1 正常小鼠初始CD4+T細(xì)胞的分選及分組 頸椎脫臼處死正常小鼠并用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡2 min，分離、收集兩側(cè)腹股溝處淋巴結(jié)，充分剪碎后用研杵研壓，加入適量RPMI 1640培養(yǎng)液， 400目篩網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞懸液并調(diào)整細(xì)胞濃度為104個(gè)/μL。采用CD4/CD62L/CD44/CD25染色方案，通過流式細(xì)胞分析儀獲取CD4+CD62LhighCD44lowCD25-初始CD4+T細(xì)胞[7]。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組和鳶尾素組。將正常小鼠初始CD4+T細(xì)胞按106個(gè)/mL加入到12孔板，同時(shí)給予Th17細(xì)胞分化條件刺激：CD3 抗體(1 mg/L)，CD28 抗體(1 mg/L)，IL-4 抗體(10 mg/L)，IFN-γ抗體(5 mg/L)，IL-6(50 μg/L),TGF-β1(10 μg/L)，IL-1β(10 μg/L)，IL-23(50 μg/L)[7]。刺激3 d后鳶尾素組加入鳶尾素(500 μg/L)繼續(xù)培養(yǎng)3 d，對(duì)照組加入等體積PBS。

1.6.2 Th17細(xì)胞分化率的檢測(cè) 分組處理完成后，檢測(cè)CD4+IL-17A+細(xì)胞比例，方法同1.5.2。

1.6.3 細(xì)胞內(nèi)丙酮酸和乳酸含量的測(cè)定 分組處理完成后，每組分別收集細(xì)胞5×107個(gè)，按照檢測(cè)試劑盒說明書操作，檢測(cè)丙酮酸含量和乳酸含量。

1.6.4 細(xì)胞內(nèi)PKM2蛋白表達(dá)的檢測(cè) 分組處理完成后，每組分別收集細(xì)胞107個(gè)，加入1 mL裂解液，反復(fù)吹打至無細(xì)胞沉淀，14 000 r/min離心3 min，取上清液分裝保存。采用Western blot法檢測(cè)PKM2蛋白表達(dá)。配制100 g/L分離膠和40 g/L濃縮膠；每孔蛋白上樣量50 ng，電泳(分離膠80 V，濃縮膠120 V)，轉(zhuǎn)膜(14 V)2 h后封閉1 h，加入PKM2抗體(1∶1 000)孵育過夜，加二抗(1∶500)室溫孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光液處理后拍照觀察，采用Image J 10分析。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量以目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。3組小鼠曠場(chǎng)中心區(qū)運(yùn)動(dòng)時(shí)間及進(jìn)入次數(shù)、糖水偏好度、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間、外周血中Th17細(xì)胞比例及IL-17A含量的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。兩組細(xì)胞Th17細(xì)胞分化率，丙酮酸、乳酸含量及PKM2表達(dá)水平的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠抑郁行為的變化見表1。與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠曠場(chǎng)中心區(qū)運(yùn)動(dòng)時(shí)間縮短，曠場(chǎng)中心區(qū)進(jìn)入次數(shù)減少，糖水偏好度降低，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)。與模型組比較，鳶尾素組小鼠曠場(chǎng)中心區(qū)運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，進(jìn)入次數(shù)增加，糖水偏好度增加，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間縮短(P<0.05)。

2.2 3組小鼠外周血中Th細(xì)胞比例及IL-17A含量的比較見表1。與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠外周血中Th17細(xì)胞比例和IL-17A含量增高(P<0.05)。鳶尾素組小鼠外周血中Th17細(xì)胞比例及IL-17A含量均較模型組降低，但仍高于正常對(duì)照組。

2.3鳶尾素對(duì)小鼠初始CD4+T細(xì)胞Th17分化及糖酵解的影響Western blot結(jié)果見圖1。兩組Th17細(xì)胞分化率、丙酮酸和乳酸含量以及PKM2表達(dá)水平的比較見表2。與對(duì)照組比較，鳶尾素組Th17細(xì)胞分化率下降，細(xì)胞內(nèi)丙酮酸、乳酸含量及PKM2表達(dá)水平降低(P<0.05)。

表1 3組小鼠曠場(chǎng)中心區(qū)運(yùn)動(dòng)時(shí)間及進(jìn)入次數(shù)、糖水偏好度、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間的比較

*:與正常對(duì)照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05

圖1 兩組細(xì)胞中PKM2蛋白的表達(dá)

表2 兩組Th17細(xì)胞分化率、丙酮酸和乳酸含量及PKM2表達(dá)水平的比較

3 討論

抑郁癥是嚴(yán)重危害人類健康的身心疾病[3]。關(guān)于其發(fā)病機(jī)制目前存在多種假說，其中免疫炎癥假說是最受關(guān)注的理論之一。該理論的核心部分是機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變導(dǎo)致Th17細(xì)胞形成增多，該類細(xì)胞通過釋放IL-17A等細(xì)胞因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)抑郁癥的發(fā)生發(fā)展。因此，阻斷Th17細(xì)胞的形成可能是具有良好應(yīng)用前景的抗抑郁藥物的開發(fā)策略[5,9]。

研究[8-11]發(fā)現(xiàn)鳶尾素具有調(diào)節(jié)代謝、抗動(dòng)脈粥樣硬化等功能，但關(guān)于鳶尾素抗抑郁的研究處于起步階段[11]。本研究以抑郁小鼠模型為研究對(duì)象，觀察了鳶尾素對(duì)抑郁小鼠行為學(xué)、外周血Th17細(xì)胞比例和IL-17A水平的影響。在抗抑郁的研究中，國(guó)外學(xué)者[8，11]主要采用腦室內(nèi)單次低劑量注射鳶尾素的方式給藥。由于鳶尾素主要由骨骼肌分泌，長(zhǎng)期規(guī)律運(yùn)動(dòng)才具有抗抑郁作用[8]，所以本研究采用連續(xù)腹腔注射的方式給藥，以使小鼠體內(nèi)鳶尾素水平的變化更加接近生理狀態(tài)。本研究結(jié)合糖水偏好度實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)證實(shí)了鳶尾素可改善抑郁小鼠的快感缺失、自發(fā)活動(dòng)減少、行為絕望等行為，具有抗抑郁作用，同時(shí)抑郁小鼠外周血Th17細(xì)胞比例和IL-17A水平也下降，提示其作用機(jī)制可能與減少小鼠外周血中Th17細(xì)胞形成有關(guān)。

代謝調(diào)控是細(xì)胞分化發(fā)育的關(guān)鍵因素之一。Th17細(xì)胞來源于初始CD4+T細(xì)胞。在內(nèi)環(huán)境利于糖酵解的代謝模式下，CD4+T細(xì)胞通過糖酵解模式供能，分化形成Th17細(xì)胞并分泌IL-17A等炎癥介質(zhì)，抑制糖酵解的關(guān)鍵酶活性可阻斷Th17細(xì)胞形成[6-7]。既往研究[8,10-11]提示鳶尾素可通過上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4、解偶聯(lián)蛋白1或下調(diào)葡萄糖-6-磷酸酶等的表達(dá)影響糖代謝并調(diào)控糖酵解。丙酮酸激酶是糖酵解的限速酶之一，其通過分解磷酸烯醇式丙酮酸產(chǎn)生丙酮酸，在無氧條件下最終形成乳酸，因此細(xì)胞中丙酮酸和乳酸含量可較好地反映糖酵解程度[7]。此外，在免疫細(xì)胞中，主要由PKM2調(diào)控糖酵解過程。本研究發(fā)現(xiàn)，鳶尾素可顯著降低正常小鼠初始CD4+T細(xì)胞的Th17細(xì)胞分化率，在此過程中細(xì)胞中丙酮酸和乳酸含量降低，PKM2表達(dá)下調(diào)；說明鳶尾素可能通過抑制PKM2的表達(dá)降低初始CD4+T細(xì)胞糖酵解水平，最終影響其向Th17細(xì)胞分化。

綜上所述，鳶尾素可通過調(diào)控CD4+T細(xì)胞的代謝，抑制Th17細(xì)胞的形成，從而減少IL-17A的分泌，發(fā)揮抗抑郁作用。這為抑郁癥的治療提供了新思路。關(guān)于鳶尾素調(diào)控PKM2表達(dá)的相關(guān)分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。