唐 煜，趙志華，于 磊，朱廣鐸，彭 誠，許朝君，鎬英杰

1)河南電力醫(yī)院兒科 鄭州 450006 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，也是兒童肉瘤相關(guān)死亡的首要原因，主要發(fā)生于股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端干骺端。骨肉瘤是高度侵襲性的腫瘤，最有可能轉(zhuǎn)移到肺[1]。骨肉瘤早期很難診斷，大約一半的患者會發(fā)生轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的患者5 a 生存率較低[2]。因此，尋找新的生物標(biāo)志物來判斷骨肉瘤的預(yù)后至關(guān)重要。

miRNA可以通過靶向調(diào)控腫瘤細(xì)胞分化、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，發(fā)揮抑癌或促癌的作用[3]。越來越多的研究[4-6]表明， miRNA表達(dá)與骨肉瘤患兒的預(yù)后關(guān)系密切。已有研究結(jié)果顯示，miR-214通過靶向TRAF3在骨肉瘤中起致癌基因的作用[7]；miR-214-3p可通過靶向CADM1促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[8]；miR-214可直接抑制LZTS1，從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[9]；miR-214表達(dá)上調(diào)與兒童骨肉瘤的進(jìn)展及不良預(yù)后有關(guān)[10]。本研究利用生物信息學(xué)方法分析miR-214的序列保守性，預(yù)測hsa-miR-214-3p的靶基因，并對其進(jìn)行功能注釋、富集性分析及信號通路富集性分析，為深入研究 hsa-miR-214-3p在骨肉瘤中的生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)，為尋找以hsa-miR-214-3p為靶點(diǎn)治療兒童骨肉瘤的方法提供理論指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)收集通過miRBase(http://www.mirBase.org/)分別檢索人、小鼠、大鼠、獼猴、黑猩猩、馬等物種的成熟miRNA序列，分析miR-214成熟序列在各物種間的保守性。利用PicTar、miRanda、RNAhybrid、TargetScan等4個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行hsa-miR-214-3p靶基因的預(yù)測，取交集，作為進(jìn)一步分析的靶基因集合。

1.2數(shù)據(jù)分析應(yīng)用R包ClusterProfiler中的Gene Ontology數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能分類及富集性分析；利用KEGG數(shù)據(jù)庫對靶基因集合進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及疾病通路富集性分析。富集顯著性閾值定為0.05。

2 結(jié)果

2.1成熟miR-214序列的保守性分析序列保守性分析結(jié)果見圖1，可見人、小鼠、大鼠、獼猴、黑猩猩、馬等多物種的成熟 miR-214序列存在完全相同的21個堿基，因而可認(rèn)為miR-214在多物種間具有較高的保守性。

2.2hsa-miR-214-3p靶基因的預(yù)測利用PicTar、miRanda、RNAhybrid、TargetScan等4個數(shù)據(jù)庫預(yù)測并取交集，共發(fā)現(xiàn)靶基因454個(圖2)。

圖1 miR-214序列保守性分析

圖2 hsa-miR-214-3p靶基因預(yù)測

2.3靶基因的功能富集分析對454個靶基因進(jìn)行功能注釋及富集分析，結(jié)果見表1～ 3。

2.4靶基因生物通路富集性分析預(yù)測的靶基因富集于TGF-β、Ras、cGMP-PKG、PI3K-Akt、Hippo、Wnt、cAMP、TNF、NF-kappa B信號通路，涉及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老、肝細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、破骨細(xì)胞分化等通路(表4)。

表1 hsa-miR-214-3p預(yù)測靶基因參與的生物學(xué)過程

續(xù)表1

表2 hsa-miR-214-3p預(yù)測靶基因參與的分子功能

表3 hsa-miR-214-3p預(yù)測靶基因的細(xì)胞組分

表4 hsa-miR-214-3p預(yù)測靶基因的信號通路富集分析

3 討論

目前，骨肉瘤的病因尚不清楚,發(fā)病的危險(xiǎn)因素有放療或化療史、Paget病或其他良性骨病變史,以及遺傳性疾病(包括遺傳性視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、Lifraumeni綜合征、Rothmund-Thomson綜合征、Bloom和Werner綜合征等)。許多因素影響整個疾病過程和結(jié)局，包括年齡、腫瘤體積、腫瘤位置、手術(shù)切除緣、術(shù)前化療的組織學(xué)反應(yīng)和無復(fù)發(fā)間隔時(shí)間等[11]。

miR-214是調(diào)控骨肉瘤發(fā)病的關(guān)鍵miRNA之一。本研究發(fā)現(xiàn)miR-214成熟序列在多物種間具有高度保守性，這說明相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)研究具有高度可信度與可推廣性。本研究結(jié)果顯示，hsa-miR-214-3p調(diào)控的靶基因參與的生物學(xué)過程主要包括囊泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)、外源性凋亡信號通路、凋亡信號通路中線粒體膜蛋白插入的調(diào)控、BMP信號通路、Ras蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控、腫瘤壞死因子介導(dǎo)的信號通路調(diào)控、骨生長、成骨細(xì)胞分化的調(diào)控、細(xì)胞衰老的負(fù)調(diào)節(jié)、TGF-β受體信號通路等；參與的分子功能包括細(xì)胞黏附分子結(jié)合、鈣黏蛋白結(jié)合、泛素樣蛋白結(jié)合、生長因子結(jié)合、NAD+激酶活性、磷脂酰肌醇磷酸鹽結(jié)合、核輸入信號受體活性、BMP受體結(jié)合、配體門控鈣通道活性、Ras-鳥苷酸交換因子活性等；參與構(gòu)成的細(xì)胞組件包括細(xì)胞-基質(zhì)連接、運(yùn)輸小泡、高爾基體相關(guān)小泡、胞外小泡、轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管狀網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞質(zhì)核糖核蛋白顆粒、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、核被膜等。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)RGMA、NEO1、ACVR1B、NBL1、ACVR2B等為hsa-miR-214-3p的潛在作用靶點(diǎn)，hsa-miR-214-3p可能通過調(diào)節(jié)這些基因間接調(diào)控TGF-β通路，從而在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)TGF-β1可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞系的遷移，具有促骨肉瘤血管生成的作用[12]。骨肉瘤患兒血清中TGF-β表達(dá)上調(diào)，其上調(diào)還與肺或其他部位的轉(zhuǎn)移、高級別骨肉瘤化療敏感性有關(guān)[13]。

本研究結(jié)果提示，Hippo通路異常在骨肉瘤生物學(xué)過程中有重要作用。Hippo通路成員中，只有YAP和TAZ在人骨肉瘤組織中被研究過。組織微陣列分析[14]結(jié)果顯示，與周圍非癌組織相比，骨肉瘤中YAP蛋白表達(dá)較高，且表達(dá)與臨床分期有關(guān)。在另一項(xiàng)免疫組化研究[15]中，骨肉瘤組織中YAP和TAZ的陽性率高達(dá)60%。本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZD7、SENP2、TBL1XR1、VANGL2、PLCB4等為hsa-miR-214-3p的潛在作用靶點(diǎn)，hsa-miR-214-3p 可能通過調(diào)節(jié)這些基因間接調(diào)控Wnt通路，從而在骨肉瘤發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[16]。骨肉瘤組織中Wnt通路蛋白過度表達(dá)，包括wnt配體、fzs和lrp受體等，編碼內(nèi)源性wnt通路抑制物(如wif-1)的基因則表觀遺傳沉默[16]。

綜上，hsa-miR-214-3p可能通過TGF-β、Hippo、Wnt等通路調(diào)控兒童骨肉瘤的發(fā)生、進(jìn)展。但當(dāng)前預(yù)測miRNA靶基因的數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)較少，存在相關(guān)生物學(xué)知識和基因數(shù)據(jù)庫不完善的缺陷，故結(jié)果存在一定的假陽性。后期我們將針對hsa-miR-214-3p在兒童骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用開展動物和臨床研究，為開發(fā)以hsa-miR-214-3p為靶點(diǎn)的兒童骨肉瘤治療藥物提供新的思路和理論依據(jù)。