張仲寧，薛東鶴 ，張婉衡，張明生，鄭國強

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院 鄭州 450001

周圍神經(jīng)的損傷及缺損會導(dǎo)致患者肢體感覺及運動功能障礙，造成生活及勞動能力的下降[1]。目前，自體神經(jīng)移植是臨床判斷神經(jīng)修復(fù)效果的金標(biāo)準(zhǔn)[2]，但是自體神經(jīng)來源有限，且存在增加創(chuàng)傷、遺留供區(qū)感覺障礙、神經(jīng)束支對合及匹配不佳等諸多缺點[3]。異體神經(jīng)移植雖避免了供體的限制，但其引起的免疫排斥反應(yīng)往往導(dǎo)致移植失敗、效果不確切等問題[4]。因此，對周圍神經(jīng)損傷的治療仍是臨床工作的一大挑戰(zhàn)。隨著組織工程技術(shù)和新型材料的發(fā)展，用生物材料構(gòu)建的神經(jīng)導(dǎo)管被逐漸應(yīng)用于修復(fù)周圍神經(jīng)損傷，在神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域有著廣闊的前景[5-6]。神經(jīng)導(dǎo)管是模仿神經(jīng)通路自然結(jié)構(gòu)的一個縱向組織，作為軸突延伸的一個通道，引導(dǎo)再生神經(jīng)與靶神經(jīng)重新相連，而導(dǎo)管本身并不影響神經(jīng)修復(fù)。將天然材料和合成材料相結(jié)合，制備兼具良好生物相容性、機械性能以及優(yōu)異的生物降解性能的神經(jīng)導(dǎo)管用于周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)已成為目前國內(nèi)外研究的熱點。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是聚乳酸(PLA)和聚羥基乙酸(PGA)的共聚物，已被FDA認(rèn)證用于創(chuàng)傷縫合[7]。PLGA在力學(xué)性能和降解時間上都具有很大的優(yōu)勢，可通過調(diào)整PLA和PGA的比例調(diào)控聚合物的強度和降解速度[7]，使得PLGA成為神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域中最具吸引力的材料。有研究[8-9]表明，細(xì)胞在材料表面的黏附、增殖、分化等一系列過程會受到材料表面的理化性質(zhì)的影響，如材料表面的親/疏水性、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和表面粗糙度等。因此組織工程材料和細(xì)胞應(yīng)有良好的接觸界面，以維持細(xì)胞表型、生長、增殖和分化，并促進(jìn)細(xì)胞特異性基因表達(dá)。在高聚物材料表面固定生物活性分子是改善材料親水性能的有效方式之一。殼聚糖是一種天然大分子，它具有優(yōu)良的生物相容性和可降解性，并常常被用作表面改性的材料。本研究通過表面截留法利用殼聚糖改善PLGA材料親水性等性能，使其更好地用作神經(jīng)修復(fù)支架。

1 材料與方法

1.1殼聚糖改性PLGA神經(jīng)導(dǎo)管的制備將PLA∶PGA(體積比)不同比例的PLGA[分別為50∶50，65∶35，70∶30，75∶25和85∶15]加入二甲基甲酰胺(DMF)和四氫呋喃(THF)(體積比為1∶1)中溶解，配制成220 g/L的靜電紡絲溶液。把注入紡絲溶液的注射器固定在KH-2型靜電紡絲機(濟南良睿科技有限公司)注射泵上，流速設(shè)為2.4 mL/h，紡絲電壓調(diào)整為20 kV。接收裝置為帶有鋁箔的旋轉(zhuǎn)滾筒，針頭與接收裝置間距18 cm，滾筒轉(zhuǎn)速1 800～2 000 r/min。將得到的PLGA纖維膜裁剪成3.5 mm×2 mm大小，在直徑1.6 mm鋼針上按 PLA組分比例增長的順序?qū)訉泳砝@，再置于PBS中靜置1 min，抽去鋼針得到PLGA神經(jīng)導(dǎo)管。

將PLGA神經(jīng)導(dǎo)管放置在20 g/L的2,2,2-三氟乙醇(TFE)中溶脹20 min，取出后分別在含有15 mg(CS-15)、20 mg(CS-20)、25 mg(CS-25)、30 mg(CS-30)殼聚糖的冰醋酸溶液(冰醋酸質(zhì)量濃度為10 g/L)中浸泡24 h，去離子水清洗并干燥。未改性的PLGA神經(jīng)導(dǎo)管為CS-0。

1.2神經(jīng)導(dǎo)管的性能測試與表征

1.2.1 形貌表征 將PLGA神經(jīng)導(dǎo)管觀察面進(jìn)行噴金處理，利用掃描電子顯微鏡(Zeiss MERLIN Compact，德國)觀察其微觀形貌。用圖像分析軟件Image J分析纖維直徑。

1.2.2 傅里葉變換紅外光譜測試 為觀察殼聚糖對PLGA神經(jīng)導(dǎo)管改性的效果，采用傅里葉變換紅外光譜儀通過衰減全反射法(ATR)對幾種神經(jīng)導(dǎo)管進(jìn)行測試，掃描范圍為4 000～500 cm-1。

1.2.3 接觸角的測定 采用表面水接觸角實驗對改性前后的導(dǎo)管支架進(jìn)行親水性表征的檢測。將PLGA神經(jīng)導(dǎo)管沿縱向裁開平鋪，滴加5 μL水，利用接觸角測量儀(上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司)在室溫條件下測定神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)表面和外表面接觸角。每個樣品測5個點取平均值。

1.2.4 孔隙率的測試 將PLGA神經(jīng)導(dǎo)管沿縱向裁開平鋪，測量其長、寬、厚以及干重，計算密度。根據(jù)表觀密度和PLGA的標(biāo)準(zhǔn)密度(ρ0=1.22 g/cm3)計算樣本的孔隙率(ε)：ε(%)=(1-ρ/ρ0)×100/%。

1.2.5 力學(xué)性能的測定 利用夾持裝置夾持PLGA神經(jīng)導(dǎo)管樣品，在萬能拉伸試驗機(EZ-LX單柱精密拉伸實驗機，島津(中國)有限公司)上進(jìn)行拉伸試驗。夾持長度為15 mm，加載速度為5 mm/min。實驗均在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓條件下進(jìn)行，采用千分尺測定樣品的厚度。每個樣品測5個點，取厚度平均值。每個樣品平行測3組數(shù)據(jù)。

1.3細(xì)胞相容性檢測

1.3.1 大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞(RSC細(xì)胞)的培養(yǎng) 用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基復(fù)蘇液氮凍存的RSC96細(xì)胞，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2 d換1次培養(yǎng)基。觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)貼壁細(xì)胞融合度達(dá)到80%時用胰蛋白酶消化傳代。

1.3.2 DMEM培養(yǎng)基預(yù)處理 將CS-0和CS-15 PLGA神經(jīng)導(dǎo)管分別放入含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，棄去導(dǎo)管，得到預(yù)處理的DMEM培養(yǎng)基。

1.3.3 CCK-8實驗 將經(jīng)1.3.2中預(yù)處理的DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)RSC96細(xì)胞12、24 和48 h后加入CCK-8，再孵育4 h后450 nm波長下測定光密度值。以未處理的DMEM培養(yǎng)基為對照組。

1.3.4 病毒感染RSC96細(xì)胞 將RSC-96細(xì)胞接種于6孔板中(5×105個/孔)。培養(yǎng)24 h后加入感染指數(shù)(MOI)=30的pCDH-CMV-EF1-copGFP慢病毒(由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室惠贈)，并加入4 mg/L Polybrene輕輕混勻。24 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。熒光顯微鏡下觀察病毒感染情況。

1.3.5 細(xì)胞種植 將CS-0和CS-15 PLGA纖維膜分別纏繞載破片，放于體積分?jǐn)?shù)3%的新潔爾滅溶液中浸泡24 h消毒滅菌，PBS清洗。將感染慢病毒的RSC96細(xì)胞以1×105個/mL加入鋪有PLGA纖維膜纏繞的載玻片的24孔板中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。對照組用無PLGA纖維膜的載玻片種植細(xì)胞。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用Graph Pad Prism 7進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析。應(yīng)用單因素方差分析比較各項觀察指標(biāo)組間的差異，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1殼聚糖改性后PLGA神經(jīng)導(dǎo)管的形貌圖見圖1、表1。殼聚糖改性后的PLGA導(dǎo)管外表面(圖1左)均有不同程度殼聚糖涂覆，且隨著殼聚糖含量增大，涂覆范圍隨之增大，纖維直徑隨之增粗。導(dǎo)管內(nèi)表面(圖1右)殼聚糖涂覆較少，纖維排列更加緊密，改性后纖維直徑增粗。

a～d：分別為15、20、25和30 mg殼聚糖改性；1～3：不同放大倍數(shù)鏡下觀；左：外表面形貌圖；右：內(nèi)表面形貌圖

表1 殼聚糖改性對PLGA神經(jīng)導(dǎo)管纖維直徑的影響(n=3) nm

2.2殼聚糖改性對PLGA神經(jīng)導(dǎo)管紅外光譜的影響紅外光譜分析結(jié)果顯示，與CS-0相比，改性后的PLGA神經(jīng)導(dǎo)管在1 647 cm-1和1 559 cm-1波長處均出現(xiàn)了殼聚糖酰胺Ⅰ與酰胺Ⅱ的特征吸收峰，表明經(jīng)改性后殼聚糖被截留在導(dǎo)管表面(圖2)。

圖2 殼聚糖改性對PLGA神經(jīng)導(dǎo)管紅外光譜圖的影響

2.3殼聚糖改性對PLGA神經(jīng)導(dǎo)管親水性的影響見圖3、表2。與CS-0 PLGA神經(jīng)導(dǎo)管的外表面、內(nèi)表面接觸角相比，經(jīng)不同濃度殼聚糖改性后PLGA神經(jīng)導(dǎo)管接觸角均有一定程度的減小。

圖3 殼聚糖改性對PLGA神經(jīng)導(dǎo)管接觸角的影響

表2 殼聚糖改性對PLGA神經(jīng)導(dǎo)管接觸角的影響(n=3)

2.4殼聚糖改性對PLGA神經(jīng)導(dǎo)管孔隙率和支架力學(xué)性能的影響見表3。從形貌分析中可以看到大量的殼聚糖黏附在纖維膜表面，覆蓋了纖維膜的孔隙。與CS-0 PLGA神經(jīng)導(dǎo)管的孔隙率相比，經(jīng)不同濃度殼聚糖改性后PLGA神經(jīng)導(dǎo)管孔隙率降低，且殼聚糖濃度越高，孔隙率的下降幅度越大。與CS-0 PLGA神經(jīng)導(dǎo)管相比，經(jīng)殼聚糖改性后PLGA神經(jīng)導(dǎo)管的力學(xué)強度均有所提高，拉伸強度分別提高了約39.4%、70.4%、74.6%和90.1%(P<0.001)。

表3 殼聚糖改性對PLGA神經(jīng)導(dǎo)管孔隙率和伸強度的影響(n=3)

2.6殼聚糖改性的PLGA神經(jīng)導(dǎo)管對RSC96細(xì)胞增殖的影響見表4。與未處理的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的RSC96細(xì)胞(對照組)相比，PLGA預(yù)處理組(CS-0組)和15 mg殼聚糖改性PLGA預(yù)處理組(CS-15組)細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明RSC96細(xì)胞在殼聚糖改性PLGA導(dǎo)管中可以正常增殖。

表4 殼聚糖改性的PLGA神經(jīng)導(dǎo)管對RSC96細(xì)胞增殖的影響(n=3)

2.7RSC96細(xì)胞在殼聚糖改性的PLGA纖維膜上的生長見圖4。將慢病毒感染的RSC96細(xì)胞種植在纖維膜上培養(yǎng)5 d后，在熒光顯微鏡下可觀察到RSC96細(xì)胞在CS-0和CS-15纖維膜上均沿纖維取向方向生長，生長為牽伸狀;而直接在玻片上生長的細(xì)胞均勻分布，且成散亂無序的狀態(tài)。

A：對照組；B：CS-0組；C：CS-15組

3 討論

本文通過靜電紡絲的方法制備出具有表面取向結(jié)構(gòu)的PLGA纖維膜，經(jīng)過高速旋轉(zhuǎn)滾筒收集到的靜電紡絲PLGA纖維呈現(xiàn)出良好的取向，并且直徑均勻，未出現(xiàn)串珠等現(xiàn)象。為了防止導(dǎo)管材料降解過快或過慢，影響再生神經(jīng)的生長，采用由內(nèi)向外增長的順序?qū)?種PLA比例的PLGA纖維膜層層卷繞，制備梯度降解的神經(jīng)導(dǎo)管支架(課題組之前的實驗數(shù)據(jù)顯示，導(dǎo)管降解發(fā)生時，PLGA從PLA∶PGA比例為50∶50到85∶15逐漸由內(nèi)層開始降解；降解持續(xù)過程中，pH值相對穩(wěn)定，在7.00～7.23浮動)。

在組織工程中,生物材料表面的親水性對種子細(xì)胞的黏附有著重要的作用[10]，適度的親水性更有利于細(xì)胞的黏附、生長和增殖[11-12]。在高分子材料表面固定生物活性分子是改善材料親水性能的有效方式之一，故本文利用殼聚糖改性PLGA纖維膜。結(jié)果顯示，殼聚糖改性的PLGA外表面纖維直徑變粗，這可能是纖維溶脹截留殼聚糖導(dǎo)致的；導(dǎo)管內(nèi)表面殼聚糖涂覆較少，纖維經(jīng)過溶脹-截留-消溶，纖維排列更加緊密，直徑較改性前有增粗，但無外表面纖維直徑改變明顯，說明導(dǎo)管內(nèi)表面截留的殼聚糖并不多；推測這可能是因為殼聚糖溶液比較黏稠、黏附在纖維膜表面，進(jìn)入內(nèi)表面較少。同時發(fā)現(xiàn)，隨著殼聚糖濃度增大，接觸角下降的幅度越大；推測由于殼聚糖是親水性天然高分子材料，殼聚糖的濃度越大，截留在導(dǎo)管表面的殼聚糖越多，從而引起了導(dǎo)管表面親水性的變化。

神經(jīng)的修復(fù)和再生的環(huán)境需要具有適當(dāng)?shù)目紫堵剩粌H為細(xì)胞的黏附、遷移、增殖提供空間，并且有利于營養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)入以及代謝產(chǎn)物的排出[13-14]。本文殼聚糖改性后導(dǎo)管支架的孔隙率均有所下降，這可能是因為殼聚糖不僅被截留在纖維內(nèi)部，同時也會黏附在纖維表面和纖維多孔結(jié)構(gòu)的空隙間，殼聚糖濃度越高，孔隙率的下降幅度越大。雖然孔隙率有所下降，但依然維持在正常的范圍以內(nèi)。

神經(jīng)導(dǎo)管支架不僅需要具有合適的孔隙率，同時還要具備合適的力學(xué)性能，為神經(jīng)細(xì)胞生長和分化提供良好的力學(xué)支撐[15]。本文通過檢測神經(jīng)導(dǎo)管的拉伸強度體現(xiàn)其力學(xué)性能。相對于改性前，隨著殼聚糖改性濃度的增加，PLGA導(dǎo)管的拉伸強度增加。這一現(xiàn)象可能是因為經(jīng)2，2，2-三氟乙醇的溶脹之后的PLGA導(dǎo)管放入殼聚糖溶液后，殼聚糖可進(jìn)入導(dǎo)管支架的層之間間隙以及纖維之間的孔隙，之后的消溶過程不僅使導(dǎo)管表面截留部分殼聚糖，在導(dǎo)管管壁間、纖維之間也截留了部分殼聚糖，使導(dǎo)管的整體結(jié)構(gòu)更加緊密，從而力學(xué)性能顯著提高。

本文中將大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞RSC96在CS-15 PLGA預(yù)處理的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞能夠正常增殖且細(xì)胞活性沒有明顯變化，表明殼聚糖改性的PLGA導(dǎo)管具有良好的組織相容性。將RSC96細(xì)胞接種至殼聚糖改性的PLGA纖維膜上培養(yǎng)，細(xì)胞的排列以及細(xì)胞突觸伸長的方向與纖維膜的取向一致，呈現(xiàn)出一定的方向性，表明細(xì)胞能夠在此導(dǎo)管上沿纖維軸向遷移生長。這一特性對于神經(jīng)引導(dǎo)性再生具有積極意義。神經(jīng)細(xì)胞的引導(dǎo)性再生可加快功能性神經(jīng)組織的延伸，促進(jìn)受損區(qū)域神經(jīng)組織與兩端正常神經(jīng)組織的橋接。

盡管如此，神經(jīng)的再生以及功能的恢復(fù)可能需還要細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、神經(jīng)生長因子等因素構(gòu)成的微環(huán)境，本文中所制備的神經(jīng)導(dǎo)管并未涉及，因此，構(gòu)建具有神經(jīng)再生微環(huán)境的PLGA神經(jīng)導(dǎo)管并進(jìn)行動物體內(nèi)實驗的驗證將是下一步的工作重點。