紀(jì)春陽， 徐秀林

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

1 引 言

惡性腫瘤是目前嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病之一[1]，全球癌癥的新發(fā)病例預(yù)計(jì)在2030 年將增加到 2 220萬例[2-3]。近年來, 隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷突破，癌癥死亡率保持了逐年下降的趨勢(shì)[4-5]，這與對(duì)癌癥的早期檢測(cè)意識(shí)的提高是密切相關(guān)的。

通過早期篩查診斷，能顯著增加癌癥治愈的機(jī)會(huì)。目前臨床上常用的檢查方法是活體組織檢查及影像學(xué)篩查，前者常?；ㄙM(fèi)大量的時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本，而影像學(xué)檢查的準(zhǔn)確性會(huì)受到圖像質(zhì)量和放射科醫(yī)師專業(yè)知識(shí)的影響[6-7]，使得患者常常錯(cuò)過最佳治療時(shí)間。因此，如何將現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的研究成果與醫(yī)學(xué)檢查和診斷有效結(jié)合，是研究人員急待解決的問題。

2 系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)

本研究開發(fā)了一種基于微流控芯片的腫瘤細(xì)胞熒光檢測(cè)系統(tǒng)，下位機(jī)電路由STM32芯片及外圍電路組成，上位機(jī)軟件系統(tǒng)基于VC++平臺(tái)搭建。微流控芯片(見圖1)的基本結(jié)構(gòu)由玻璃基板與PDMS(聚二甲基硅氧烷)層組成[8]，可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本血液中的腫瘤、紅、白細(xì)胞的分選[9-10]，本研究使用的芯片內(nèi)部管道寬度為340 μm、高度為100 μm，借助微流控芯片精密微通道使腫瘤細(xì)胞依次流過檢測(cè)區(qū)域。

2.1 光路結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

本研究的光路結(jié)構(gòu)采用反射式共焦距結(jié)構(gòu)，選擇光強(qiáng)可調(diào)式LED作為激發(fā)光源。激發(fā)光先由濾光片進(jìn)行固定波長(zhǎng)篩選，再由透鏡對(duì)其進(jìn)行初次聚焦，二向色鏡起到了折射的作用，使激發(fā)光充分地投射到待檢測(cè)物上。當(dāng)入射光照射在被熒光染料標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞時(shí)，使細(xì)胞表面的熒光素中，原本處于基態(tài)的原子向激發(fā)態(tài)進(jìn)行躍遷，產(chǎn)生比入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的熒光，激發(fā)光最終被光電探測(cè)器采集。光路示意圖見圖2(a)，光路實(shí)物圖見圖2(b)。

圖1 微流控芯片

圖2檢測(cè)系統(tǒng)光路結(jié)構(gòu)

(a).光路示意圖;(b).光路實(shí)物圖

Fig.2Optical path structure of detection system

(a).optical path diagram;(b).optical path physical map

2.2 電路設(shè)計(jì)

圖3電路結(jié)構(gòu)圖

Fig.3Circuit structure diagram

2.3 軟件設(shè)計(jì)

為使檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)可視化與檢測(cè)結(jié)果的錄入，本研究同時(shí)設(shè)計(jì)了一套基于VS2015平臺(tái)、Duilib框架的可視化軟件系統(tǒng)。軟件系統(tǒng)由患者信息管理模塊、腫瘤細(xì)胞檢測(cè)模塊和打印報(bào)告模塊組成。

患者信息管理模塊的功能包括：患者信息錄入、查看、修改、刪除；腫瘤細(xì)胞檢測(cè)模塊將下位機(jī)采集到的數(shù)據(jù)，經(jīng)處理之后進(jìn)行顯示、并繪制成曲線圖，以便直觀地觀測(cè)腫瘤細(xì)胞的檢出率及統(tǒng)計(jì)結(jié)果。最后將操作人員、患者信息、檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)、腫瘤細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)后打印病理報(bào)告，以輔助醫(yī)生診斷。

3 細(xì)胞熒光信號(hào)采集與電路設(shè)計(jì)

3.1 光電轉(zhuǎn)換模塊

光電倍增管(PMT)通常用于捕捉微弱發(fā)射源產(chǎn)生的低光信號(hào)，在本研究中，PMT用于探測(cè)被熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞所激發(fā)的微弱熒光信號(hào)。在型號(hào)選擇方面，參照了光譜響應(yīng)范圍、光輻射靈敏度、噪聲、陽極脈沖上升時(shí)間等技術(shù)參數(shù)，選擇索雷博公司生產(chǎn)的PMT1002光電倍增管模塊。該型號(hào)探測(cè)器響應(yīng)光輻射響應(yīng)頻段為(230～920) nm，并在630 nm處達(dá)到峰值。噪聲在0.6 mV左右，該模塊在響應(yīng)時(shí)輸出在(-1.5～+1.5) V，可將該微弱噪聲忽略不計(jì)。陽極脈沖上升時(shí)間為0.57 ns，可適用于常規(guī)檢測(cè)平臺(tái)的高速細(xì)胞流道，有效避免細(xì)胞漏檢等情況的發(fā)生。光電轉(zhuǎn)換模塊內(nèi)部結(jié)構(gòu)見圖4。

圖4 光電轉(zhuǎn)換模塊內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖

Fig.4Internal structure diagram of photoelectric conversion module

3.2 STM32F103C8T6芯片

STM32主控模塊采用32位微處理器芯片STM32F103C8T6，ARM Cortex-M3內(nèi)核作為中央控制芯片。在額定工作狀態(tài)下，該芯片具有超過80個(gè)高速GPIO口對(duì)電壓和電流分辨率分別為0.8 mV和1 nA，內(nèi)置I2C通訊接口實(shí)現(xiàn)了與A/D芯片通信橋梁，并且與上位機(jī)通信使用的串口最高傳輸速度可達(dá)4.5 Mbps，可滿足腫瘤細(xì)胞熒光檢測(cè)的準(zhǔn)確性與實(shí)時(shí)性要求。

3.3 A/D轉(zhuǎn)換

ADS1115是一款兼容I2C的16位高精度低功耗的數(shù)模轉(zhuǎn)換器。該芯片最高轉(zhuǎn)換速率達(dá)到每秒860個(gè)數(shù)據(jù)，并且該芯片內(nèi)置了多路復(fù)用器 (MUX)，實(shí)現(xiàn)兩次差動(dòng)輸入測(cè)量或四次單端輸入測(cè)量。

A/D轉(zhuǎn)換過程如下：

芯片首先上電并初始化，在接收模式下，收到主機(jī)發(fā)送的第一個(gè)8位start指令后，將R/W位置0進(jìn)入寫模式，配置指定寄存器并應(yīng)答轉(zhuǎn)換寄存器的LSB、MSB。執(zhí)行確認(rèn)指令(ACK)，當(dāng)指令通過完整性檢查后，對(duì)寄存器地址指針進(jìn)行解碼，芯片進(jìn)入待機(jī)狀態(tài)，等待主機(jī)下一次start指令。

A/D芯片確認(rèn)寄存器位置后將數(shù)據(jù)寫入。如果待讀取寄存器不是剛剛完成寫入的寄存器，則需對(duì)下一次指令中地址指針的數(shù)值進(jìn)行修改。

本文認(rèn)為，不同程序中不同的價(jià)值導(dǎo)向在起最終的作用。在專利授權(quán)程序中，權(quán)利要求理解的價(jià)值導(dǎo)向在于：促使專利申請(qǐng)人修改申請(qǐng)文件從而以更加明確的措辭或術(shù)語來限定其保護(hù)范圍。在專利確權(quán)程序中，權(quán)利要求理解的價(jià)值導(dǎo)向在于：既要考慮授權(quán)權(quán)利要求的公示作用，又要考慮其實(shí)際技術(shù)貢獻(xiàn)，從而更好地在保護(hù)專利權(quán)人的創(chuàng)新與由權(quán)利要求公示作用所體現(xiàn)的保障公眾合法權(quán)益之間維持平衡。在專利民事侵權(quán)程序中，權(quán)利要求解釋的價(jià)值導(dǎo)向在于：對(duì)一項(xiàng)具有技術(shù)貢獻(xiàn)的發(fā)明匹配合理的保護(hù)范圍從而作出侵權(quán)與否的判斷。不同的價(jià)值導(dǎo)向使得不同程序中權(quán)利要求保護(hù)范圍的理解和解釋的基本規(guī)則不盡相同。

接收到主機(jī)發(fā)送start指令后，將R/W位置1進(jìn)入讀模式，依次讀取數(shù)據(jù)的高八位與低八位，并將高位右移八位組成16位的數(shù)據(jù)結(jié)果。此時(shí)一次轉(zhuǎn)換完成。A/D轉(zhuǎn)換電路見圖5。

圖5A/D轉(zhuǎn)換電路圖

Fig.5A/D conversion circuit diagram

3.4 串口通訊模塊

串口模塊核心結(jié)構(gòu)由平衡驅(qū)動(dòng)器和差分接收器構(gòu)成，使其數(shù)據(jù)最高傳送速率達(dá)到10 Mbps且具有抗噪聲、高共模抑制比的特點(diǎn)。但其接口處易產(chǎn)生電流震蕩，需外接電壓調(diào)置電路才能使其穩(wěn)定工作。

本研究使用美信公司生產(chǎn)的MAX232芯片作為電壓調(diào)置電路的核心器件，+5 V循環(huán)充電的外接電容用于穩(wěn)定輸出電壓。串口通訊電路見圖6。

圖6 串口通訊電路圖

Fig.6Serial communication circuit diagram

3.5 供電模塊

供電芯片選擇ASM1117-3.3 V和ASM1117-5.0 V兩種，二者均由奧地利微電子公司生產(chǎn)。該穩(wěn)壓芯片在-40～125℃時(shí)可保持正常工作，滿足設(shè)備在長(zhǎng)時(shí)間與非常溫環(huán)境下的細(xì)胞檢測(cè)需要，并且其輸出電壓誤差不超過1%。

在實(shí)際工作中，輸入電源通常夾雜一些高低頻干擾。為消除噪音影響，在芯片輸入、輸出端并聯(lián)兩個(gè)47 uf電解電容與0.1 uf瓷片電容。前者具有大容量、高交流阻抗的特點(diǎn)，但其對(duì)高頻噪聲抑制效果不明顯，而后者高頻特性好、容量較小，為更好地消除高低頻噪聲與降低ESL(串聯(lián)等效電感)、ESR(串聯(lián)等效電阻)，將二者搭配使用，使電路系統(tǒng)處于更加穩(wěn)定的工作狀態(tài)。供電模塊見圖7。

圖7 供電模塊電路圖

4 系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)

4.1 患者信息管理模塊

患者信息管理模塊采用VC++開發(fā)，數(shù)據(jù)庫(kù)為Microsoft關(guān)系型數(shù)據(jù)庫(kù)sql server 2005，可將數(shù)據(jù)文件、數(shù)據(jù)日志進(jìn)行簡(jiǎn)單加密，對(duì)患者隱私、診療方案進(jìn)行保密處理。使用ado的方式連接到VC++，實(shí)現(xiàn)了對(duì)患者信息數(shù)據(jù)的跨平臺(tái)調(diào)用。

在VC++開發(fā)環(huán)境中，首先新建用于鏈接ado的類，將生成的頭文件adosql.h、源文件adosql.cpp、msado15.dll動(dòng)態(tài)鏈接庫(kù)導(dǎo)入到主程序中。創(chuàng)建指向數(shù)據(jù)庫(kù)的指針(m_pConnection)，初始化指針使其指向SQL數(shù)據(jù)庫(kù)中的患者信息表(paient)。為了跨平臺(tái)對(duì)數(shù)據(jù)的讀取與修改，將許可權(quán)參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)狀態(tài)(adModeUnknown)。

4.2 報(bào)告打印模塊

本研究的報(bào)表使用書簽與光標(biāo)混合的形式進(jìn)行編輯，有效避免串位、亂碼等情況的發(fā)生。導(dǎo)入word類庫(kù)，從office 2016安裝路徑中找到MSWORD.OLB文件，導(dǎo)入_Application、 _Document、Range、Cell等類。為方便在軟件系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)報(bào)表生成，提前在word中創(chuàng)建好一個(gè)模板，并在需要填入、更新的位置插入書簽。系統(tǒng)使用OLE技術(shù)(對(duì)象連接與嵌入)實(shí)現(xiàn)了對(duì)Word文檔連接。報(bào)告打印預(yù)覽見圖8。

圖8 報(bào)告打印預(yù)覽圖

5 實(shí)驗(yàn)分析

將異硫氰酸熒光素(FITC)[11-12]對(duì)人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞系MDA-MB-453進(jìn)行熒光標(biāo)記，每次實(shí)驗(yàn)取5 mL濃度為1×102Cell /mL的細(xì)胞溶液作為試驗(yàn)的樣品。為確保FITC染色效果的穩(wěn)定性與有效性，實(shí)驗(yàn)前在熒光顯微鏡下觀察激發(fā)熒光效果。圖9為 FITC 熒光標(biāo)記后的MDA-MB-453 細(xì)胞懸浮液的熒光激發(fā)效果圖。為驗(yàn)證采集熒光標(biāo)記細(xì)胞的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)功能與探究不同進(jìn)樣速度對(duì)檢出率的影響，將磷酸緩沖鹽溶液(PBS緩沖液)與不同進(jìn)樣速度作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。打開光源、檢測(cè)電路、光電倍增管上電并將微流控芯片放置在光探頭檢測(cè)窗口區(qū)域。設(shè)置好檢測(cè)參數(shù)后，微量進(jìn)樣注射泵將樣品以4、6、8 mL/h的速度將細(xì)胞液注射入微流控芯片中。為驗(yàn)證該檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，在第一組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，間隔3 d后按照以上步驟重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行2組實(shí)驗(yàn)，為避免重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中的干擾，在每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用PBS緩沖液反復(fù)對(duì)微流控芯片進(jìn)行清洗，確保無殘留腫瘤細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 腫瘤細(xì)胞檢出率結(jié)果

檢出率為實(shí)際被檢出的細(xì)胞數(shù)量與應(yīng)該被檢出的細(xì)胞個(gè)數(shù)的比值。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，各組平均檢出率為85.36%、85.85%、85.65%、85.06%、70.56%、71.68%，且組內(nèi)相關(guān)系數(shù)均高于0.80。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在保證檢測(cè)精度的同時(shí)，最大地提升檢測(cè)速度，可將進(jìn)樣速度設(shè)置為6 mL/h。

圖9FITC染色 MDA-MB-453激發(fā)效果圖

Fig9Excitation effect of FITC dyeing MDA-MB-453

6 結(jié)論

本研究開發(fā)了一種基于微流控芯片的腫瘤細(xì)胞熒光檢測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)的光路結(jié)構(gòu)采用反射式共焦距結(jié)構(gòu)，有效利用激發(fā)光源的同時(shí)降低雜散光的影響；光電探測(cè)器內(nèi)置跨阻放大器與DAC調(diào)制的光電探測(cè)器精準(zhǔn)探測(cè)與采集熒光信號(hào)；A/D高精度數(shù)模轉(zhuǎn)換器ADS1115在高效轉(zhuǎn)換模擬信號(hào)的同時(shí)，也對(duì)其進(jìn)行降功耗處理；在多個(gè)供電處外接電解電容與瓷片電容，以消除高低頻噪聲，使電路系統(tǒng)處于穩(wěn)定的工作狀態(tài)。

但本研究還存在以下不足之處：當(dāng)光電探測(cè)器探頭與待檢細(xì)胞的距離產(chǎn)生微小變化時(shí)，便會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生較大影響。本研究中的光學(xué)檢測(cè)平臺(tái)為手動(dòng)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)，應(yīng)設(shè)計(jì)成固定結(jié)構(gòu)或添加鏡頭位移調(diào)整裝置，使每次工作時(shí)，光電探頭自動(dòng)移動(dòng)到固定檢測(cè)位置。因腫瘤患者血液樣本獲取難度較大，同時(shí)血液中成分復(fù)雜，本研究使用稀釋過的人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞系MDA-MB-453溶液作為模擬血液。為了進(jìn)一步驗(yàn)證本研究的可靠性，應(yīng)使用腫瘤患者循環(huán)血作為研究樣品。本研究中樣品熒光標(biāo)記方式為免疫熒光標(biāo)記，即抗原抗體反應(yīng)，但在研究過程中，被標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞經(jīng)微流控芯片離心、富集、篩選過后，表面抗原的脫落現(xiàn)象會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響，因此可改為熒光酶標(biāo)記質(zhì)粒法。