董浩，馬麗霞，吳倩倩，王憲朋，朱愛(ài)臣，李文明，王勤，王傳棟，劉陽(yáng)

(山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省醫(yī)用高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250101)

1 引 言

緩釋藥物制劑主要包括植入體、微球、膜劑、凝膠、脂質(zhì)體等，其中長(zhǎng)效緩釋微球因具有可靶向性、藥物穩(wěn)定性高、緩釋周期長(zhǎng)等特點(diǎn)，一直是各國(guó)學(xué)者的研究熱點(diǎn)[1]。該微球制劑采用乙交酯-丙交酯共聚物(PLGA)為載體，藥物釋放周期可達(dá)2周、4周、8周或更長(zhǎng)，緩釋對(duì)象以多肽、蛋白類(lèi)及部分小分子化學(xué)藥物為主[2-3]，臨床上多用于治療腫瘤、精神障礙、退化性病變等疾病[4-6]。PLGA作為微球制劑的載體，在國(guó)內(nèi)雖已載入藥典，但主要關(guān)注于特性粘度、共聚物組成、分子量及其分布等性能指標(biāo)[7]，而聚合物鏈段長(zhǎng)度及分布等微結(jié)構(gòu)對(duì)載體性能和緩釋效果的影響未見(jiàn)報(bào)道。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，鏈段序列長(zhǎng)度，尤其是乙交酯序列長(zhǎng)度(LGG)影響聚合物降解速率和溶解性，進(jìn)而影響制劑工藝和藥物釋放情況[8-9]。當(dāng)LGG<3時(shí)，聚合物降解速度較快，部分藥物突釋現(xiàn)象明顯，而當(dāng)LGG>5時(shí)，聚合物在絕大部分有機(jī)溶劑中溶解性變差，嚴(yán)重妨礙制劑制備工藝研究。為此，對(duì)PLGA5050在聚合過(guò)程中發(fā)生的二級(jí)酯交換反應(yīng)與共聚物微結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，通過(guò)改變催化劑用量與反應(yīng)時(shí)間，研究其對(duì)聚合過(guò)程中的二級(jí)酯交換反應(yīng)的影響和對(duì)共聚物微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響，以求將LGG控制在合理范圍，從而控制整個(gè)聚合物的降解速率和溶解性，滿(mǎn)足長(zhǎng)效緩釋微球的藥物釋放要求。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 原料和試劑

丙交酯(LA)，純度99.5%，自制；乙交酯(GA)，純度99.5%，自制；辛酸亞錫，分析純，Sigma公司；氯仿，色譜純，美國(guó)JT. Baker公司；乙醇，分析純，天津市百世化工有限公司；二氯甲烷，分析純，天津市百世化工有限公司。

2.2 共聚物的合成

準(zhǔn)確稱(chēng)量摩爾比為1∶1的丙交酯和乙交酯加入反應(yīng)瓶中，依次加入一定量的辛酸亞錫和十二醇為催化劑和引發(fā)劑，在真空條件下，150℃開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)一定時(shí)間后得到聚合物，產(chǎn)物用二氯甲烷溶解，乙醇沉淀純化，經(jīng)真空干燥后，得到一系列PLGA5050共聚物固體。

2.3 表征與測(cè)試

1H-NMR和13C-NMR表征：采用德國(guó)Bruker公司 Avance 400 MHz型核磁共振儀，以氘代六氟異丙醇為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定共聚物的1H-NMR和13C-NMR。

GPC表征：采用美國(guó)Waters 凝膠滲透色譜儀(Waters 2414檢測(cè)器，Waters1515泵，Waters 2707自動(dòng)進(jìn)樣器)，以氯仿為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，聚苯乙烯(PS)為標(biāo)準(zhǔn)樣，對(duì)聚合物的數(shù)均分子量(Mn)及其分布(Mw/Mn)進(jìn)行表征。

3 結(jié)果與討論

3.1 催化劑用量與反應(yīng)時(shí)間對(duì)聚合反應(yīng)的影響

以常用的辛酸亞錫為催化劑，用量分別為0.05%、0.2%、0.5%(w/w)，在150℃、70 Pa的條件下，控制不同反應(yīng)時(shí)間，得到一系列PLGA5050共聚物。共聚物的1H-NMR見(jiàn)圖1，δ1.5～1.7 ppm為丙交酯單元的甲基質(zhì)子(CH3)特征峰；δ4.6～5.0 ppm 為乙交酯單元的亞甲基質(zhì)子(CH2)特征峰；δ5.1～5.4 ppm區(qū)域?yàn)楸货卧械拇渭谆|(zhì)子(CH)特征峰。根據(jù)丙交酯單元上的次甲基和乙交酯單元上的亞甲基的質(zhì)子共振峰積分面積計(jì)算共聚物各組分含量，并考察其顏色、溶解性、收率、分子量及其分布等變化情況，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 PLGA5050共聚物1H-NMR圖

由表1可以看出，對(duì)于相同催化劑用量，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，聚合產(chǎn)物顏色均逐漸加深，在氯仿中的溶解性逐漸變好。與此同時(shí)，隨著催化劑用量的增加，對(duì)于同樣的反應(yīng)時(shí)間，聚合物的顏色和溶解性顯示出相同的現(xiàn)象。溶解性是影響聚合物應(yīng)用于緩釋藥物載體的重要因素，我們推測(cè)這可能與聚合物的微結(jié)構(gòu)，尤其是乙交酯鏈段的平均序列長(zhǎng)度LGG有關(guān)。

由表1還可看出，共聚物中乙交酯組分摩爾含量均在50%左右，與投料摩爾含量基本一致。而且，可溶于氯仿的聚合物數(shù)均分子量(Mn)均達(dá)到40 000～55 000，分子量分布較窄，分布系數(shù)(Mw/Mn)均在1.5～1.7，聚合物收率均在90%以上。說(shuō)明聚合過(guò)程中丙交酯和乙交酯的聚合速率雖然不同，但聚合時(shí)間較長(zhǎng)，兩者的開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)較完全，共聚單體均參與了聚合反應(yīng)并加入到聚合物鏈中，共聚物分子量分布較為均勻。

表1 催化劑用量與反應(yīng)時(shí)間對(duì)PLGA5050共聚物性能的影響

注：對(duì)于氯仿中不溶的共聚物，無(wú)法測(cè)定分子量及其分布。

3.2 PLGA5050共聚物微結(jié)構(gòu)表征

丙交酯(LA)和乙交酯(GA)在聚合時(shí)發(fā)生的酯交換反應(yīng)有兩種模式[10]，一種是發(fā)生在-LL-單元(L表示乳酰結(jié)構(gòu)單元(-CH(CH3)COO-))和-GG-單元(G表示乙酰結(jié)構(gòu)單元(-CH2COO-))或它們多重單元之間的酯交換，即一級(jí)酯交換，其結(jié)果是聚合物鏈增長(zhǎng)；另一種是上述單元或多重單元發(fā)生斷裂重排，即發(fā)生二級(jí)酯交換，其結(jié)果是形成-LGL-或-GLG-序列結(jié)構(gòu)，以及-LGGGL-和-GLLLG-及其它微結(jié)構(gòu)中具有奇數(shù)L或奇數(shù)G單元的序列結(jié)構(gòu)[11-13]。將1H-NMR圖中乙交酯序列結(jié)構(gòu)的亞甲基質(zhì)子(CH2)特征峰進(jìn)行歸屬[11-13]，見(jiàn)圖2和表2。

L和G結(jié)構(gòu)單元由于酯交換后所處微結(jié)構(gòu)的化學(xué)環(huán)境不同，其特征峰在核磁譜圖中表現(xiàn)出相應(yīng)的化學(xué)位移變化。將13C-NMR圖中L單元和G單元的酯羰基碳的共振峰進(jìn)行歸屬[11-13]，見(jiàn)圖3。可見(jiàn)PLGA5050共聚物的L結(jié)構(gòu)單元中的酯羰基碳共振峰附近均可觀察到-GLG-序列所對(duì)應(yīng)的共振峰。

圖2 PLGA5050共聚物中的乙交酯亞甲基質(zhì)子1H-NMR圖

表2 PLGA5050共聚物1H-NMR圖中乙交酯序列特征峰歸屬表

圖3PLGA5050共聚物中的酯羰基碳13C-NMR圖

Fig.3Carbonyl signalsin13C-NMR spectra of PLGA5050copolymer

3.3 催化劑用量與反應(yīng)時(shí)間對(duì)聚合過(guò)程中二級(jí)酯交換的影響

PLGA共聚物中-GG-單元的二級(jí)酯交換系數(shù)TⅡ[LGL]和-LL-單元的二級(jí)酯交換系數(shù)TⅡ[GLG]可按以下公式計(jì)算[11-13]：

TⅡ[LGL]=[LGL]/[LGL]R

(1)

TⅡ[GLG]=[GLG]/[GLG]R

(2)

式中的[LGL]和[GLG]分別為共聚物中LGL和GLG序列的實(shí)際相對(duì)分?jǐn)?shù)，通過(guò)核磁積分面積計(jì)算。[LGL]R和[GLG]R可按Bernoulian公式計(jì)算得到的兩個(gè)序列的理論相對(duì)分?jǐn)?shù)：

[LGL]R=k/(k+1)3

(3)

[GLG]R=k2/(k+1)3

(4)

式中的k=[G]/[L]分別是共聚物中-G-和-L-結(jié)構(gòu)單元的分?jǐn)?shù)，是根據(jù)1H-NMR譜中-L-單元上的次甲基質(zhì)子(CH)和-G-單元上的亞甲基質(zhì)子(CH2)的共振峰積分面積計(jì)算的。根據(jù)式(1)和式(2)計(jì)算的PLGA共聚物的二級(jí)酯交換系數(shù)見(jiàn)表3。

由表3可以看出，在相同催化劑用量條件下，共聚物的TⅡ[GLG]和TⅡ[LGL]均呈現(xiàn)隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大的趨勢(shì)；而在相同反應(yīng)時(shí)間時(shí)，催化劑用量越大，共聚物二級(jí)酯交換系數(shù)越大，說(shuō)明共聚過(guò)程中發(fā)生了明顯的酯交換反應(yīng)，導(dǎo)致序列結(jié)構(gòu)重新分布，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，二級(jí)酯交換反應(yīng)的發(fā)生使-LL-或-GG-單元及其多重單元發(fā)生斷裂，形成更多的-GLG-和-LGL-序列結(jié)構(gòu)。而催化劑的引入加速了單體開(kāi)環(huán)聚合的反應(yīng)速率，進(jìn)而加速了二級(jí)酯交換反應(yīng)的速率，使-GLG-和-LGL-序列結(jié)構(gòu)增多，這與辛酸亞錫催化劑作為共引發(fā)劑引發(fā)丙交酯乙交酯開(kāi)環(huán)聚合的機(jī)理一致[10]。

由表3還可以看出，同一樣品的TⅡ[LGL]顯著小于TⅡ[GLG]，說(shuō)明聚合過(guò)程中-LL-單元的二級(jí)酯交換反應(yīng)比-GG-單元的二級(jí)酯交換反應(yīng)顯著。由于GA的聚合速率遠(yuǎn)大于LA，反應(yīng)過(guò)程中首先是GA與GA反應(yīng)生成較長(zhǎng)的-GG-結(jié)構(gòu)序列，聚合體系中GA的濃度不斷下降，而LA的濃度相比GA較大，在LA與LA及LA與-GG-單元反應(yīng)的同時(shí)，生成的-LL-序列與-GG-單元發(fā)生分子間的二級(jí)酯交換反應(yīng)的幾率增大，從而形成較多的-GLG-序列結(jié)構(gòu)。

3.4 催化劑用量與反應(yīng)時(shí)間對(duì)共聚物平均序列長(zhǎng)度的影響

PLGA共聚物分子鏈中-LL-和-GG-序列的平均長(zhǎng)度可根據(jù)以下公式計(jì)算：

LLL=ILL/ILG+ 1 (5)

LGG=IGG/IGL+ 1 (6)

表3 催化劑用量與反應(yīng)時(shí)間對(duì)PLGA5050共聚物二級(jí)酯交換的影響

式中的ILL、ILG、IGG和IGL分別對(duì)應(yīng)LLLL、LLGG、GGGG和GGLL單元13C-NMR共振峰(見(jiàn)圖4)的積分強(qiáng)度。

由圖4可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，ILG逐漸增大，與ILL的差距逐漸縮小，直至120 h與ILL較接近，同樣，IGL與IGG的差距隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減小，最后趨于接近。根據(jù)式(5)和式(6)計(jì)算的平均序列長(zhǎng)度LLL和LGG見(jiàn)表4。

由表4可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，共聚物-LL-和-GG-序列的平均長(zhǎng)度均逐漸減小，LLL由4逐漸減至2左右，LGG也由5逐漸減至2左右，說(shuō)明聚合過(guò)程中共聚物分子鏈由微嵌段向無(wú)規(guī)的方向轉(zhuǎn)變(無(wú)規(guī)共聚物L(fēng)LL=2，LGG=2)，這可能是因?yàn)镚A與LA聚合速率的差異造成了-GG-單元微嵌段結(jié)構(gòu)首先生成，隨后-LL-單元微嵌段也逐漸形成，隨著聚合過(guò)程中發(fā)生的二級(jí)酯交換反應(yīng)，使-GG-或-LL-單元及其多重單元發(fā)生斷裂，形成更多的-GLG-和-LGL-序列結(jié)構(gòu)，共聚物分子鏈的微嵌段逐漸減少，而表現(xiàn)出無(wú)規(guī)分布的特點(diǎn)。這與前述的聚合過(guò)程中逐漸增加的二級(jí)酯交換反應(yīng)規(guī)律相一致。

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間PLGA5050共聚物酯羰基碳13C-NMR圖

表4 催化劑用量與反應(yīng)時(shí)間對(duì)PLGA5050共聚物平均序列長(zhǎng)度的影響

見(jiàn)圖5，不同催化劑用量條件下，共聚物乙交酯鏈段序列長(zhǎng)度(LGG)隨反應(yīng)時(shí)間均逐漸減小，并最終趨于穩(wěn)定(LGG=2.2～2.5)，聚合物嵌段性逐漸降低，這也與它們?cè)诼确轮械娜芙庑宰兓?guī)律一致，見(jiàn)表1。而且，隨催化劑用量增多，在相同的反應(yīng)時(shí)間條件下，LGG下降顯著，如聚合反應(yīng)達(dá)12 h，催化劑用量由0.05%增加到0.2%，LGG下降了22.3%，用量增加到0.5%時(shí)，LGG下降了32.7%，顯示出聚合物嵌段性明顯降低。

由表4和圖5可以看出，三種催化劑用量均得到了LGG為3～5之間的聚合物，然而催化劑用量較少時(shí)，反應(yīng)更為溫和，反應(yīng)時(shí)間的可調(diào)控范圍更大，更容易合成LGG為3～5之間的微嵌段聚合物。

圖5 乙交酯鏈段平均序列長(zhǎng)度(LGG)隨反應(yīng)條件變化曲線(xiàn)圖

4 結(jié)論

本研究以辛酸亞錫為催化劑，采用本體開(kāi)環(huán)聚合法制備了一系列PLGA5050共聚物，研究了不同催化劑用量和不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)共聚物微結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明：

(1)共聚物組成與投料摩爾比基本一致，共聚物數(shù)均分子量40 000～55 000，分子量分布較為均勻，分布系數(shù)(Mw/Mn)均在1.5～1.7，收率>90%。

(2)隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)和催化劑用量增多，聚合過(guò)程中的二級(jí)酯交換反應(yīng)明顯，導(dǎo)致形成更多的-GLG-和-LGL-序列結(jié)構(gòu)。

(3)隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)和催化劑用量增多，共聚物的平均序列長(zhǎng)度(LLL或LGG)逐漸減小，催化劑用量較高時(shí)，減小更為顯著，共聚物由微嵌段向無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)的方向轉(zhuǎn)變。

(4)不同催化劑用量條件下，均可得到LGG為3～5之間的聚合物，當(dāng)催化劑用量為0.05%時(shí)，反應(yīng)速度更溫和，反應(yīng)時(shí)間范圍更大，更有利于LGG為3～5的PLGA5050微嵌段共聚物的合成。