閔令圓,龐靖祥,楊美娜,周寶宸,荊綺,韓金祥△

(1. 濟南大學 山東省醫(yī)學科學院 醫(yī)學與生命科學學院，濟南 250020；2. 山東省醫(yī)藥生物技術研究中心 山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)， 濟南 250062)

1 引 言

中藥藥性之四氣亦稱四性，中國藥典對所有的中藥均進行了“藥性”的描述，即寒、熱、溫、涼。但目前仍缺乏一種公認的對中藥藥性的量化指標。生物光子輻射，也稱為超微弱生物發(fā)光(UPE),廣泛存在于植物、動物、微生物與藻類中，強度較低[1]。目前，UPE測量用于評估氧化狀態(tài)和用于表征人體光學狀態(tài)等[2-3]。超微弱發(fā)光起源于生物系統(tǒng)內(nèi)一個高度相干的電磁場,攜帶著生命系統(tǒng)內(nèi)部的完整信息，這便是生物光子相干性理論[4-5]。我們發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥理論與生物光子相干性理論存在可通約性[6]，“氣”與機體電磁輻射基本特征相一致，于是有研究提出可用生物光子相干性理論等現(xiàn)代理論及其技術轉化中醫(yī)藥理論[7]。經(jīng)過大量研究后發(fā)現(xiàn)，利用柵藻作為生物指示劑，加入中藥煎煮液，測量其延遲發(fā)光動力學數(shù)據(jù)，將其延遲發(fā)光的平均強度 (IW) 與時間 (t) 進行線性擬合，得到的線性擬合方程斜率K可以定量化表征中藥藥性[8-11]。

利用柵藻作為生物指示劑來定量化表征中藥藥性，該方法具有操作簡單、靈敏度高、易于獲得等特點。 并且相比還原論的方法，運用生物光子相干性理論研究中藥藥性是以整體論為哲學思想，契合中醫(yī)基礎理論。為了進一步將該方法標準化，我們對柵藻的波動范圍進行了優(yōu)化，并參照中國藥典中所規(guī)定的標準[12-14]，對其儀器背景噪聲、精密度、穩(wěn)定性、重復性、空白溶劑干擾等項目進行了相關檢測，從而大大提高了柵藻延遲發(fā)光表征中藥藥性這一方法的準確性、科學性和可行性，也為建立一種符合中醫(yī)藥理論基礎的藥性評價體系與指標奠定了基礎。

2 實驗材料

生物指示劑：柵藻(Scenedesmus sp.)，編號 FACHB-933，購于中國科學院武漢水生生物研究所， 使用 BG11 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。柵藻批次1，2018年6月8日購入；柵藻批次2，2019年1月2日購入。

主要儀器設備：YPMS-2生物光子測量儀、PM20SP型光電倍增管高壓電源、尤尼科紫外分光光度計、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、智能光照培養(yǎng)箱、尚朋堂電陶爐、康舒砂鍋、石英比色皿、ACCULAB電子天平、燒杯、250 mL量筒、50 mL離心管、錐形瓶、移液槍。

中藥：黃芩，產(chǎn)地河北，購自山東建聯(lián)盛嘉中藥有限公司中藥飲片廠。

3 實驗方法

3.1 柵藻波動范圍測定

柵藻混合液在波長680 nm下吸光度 (A) 與細胞濃度 (C) 的線性方程為C= (A×11.995+0.1502 ) × 106個/mL ( r2= 0.9766 )。實驗中選取兩個不同批次柵藻，控制其吸光度A=2.5(即C=3.0×107個/mL)

調(diào)節(jié)檢測室溫度為恒溫20 ℃，調(diào)節(jié)生物光子測量儀YPMS-2至性能最佳狀態(tài)，即制冷系統(tǒng)溫度-21℃，高壓1 348 V，保證儀器的最佳靈敏度和信噪比。將3 mL吸光度A=2.5的柵藻混合溶液轉入石英比色皿中，放入YPMS-2生物光子測量儀的暗室內(nèi)，進行激發(fā)延遲發(fā)光的檢測。儀器設置為光源∶White-LED；測量點∶900；選擇測量方法∶DL；測量時間∶1.000000；光照時間∶10；重復次數(shù)∶7。實驗前后均進行儀器空箱噪聲測量，保證前后測量數(shù)值無統(tǒng)計學差異，以確定儀器的穩(wěn)定性及結果的準確性。并使用相同方法連續(xù)測量41～60 d內(nèi)柵藻的延遲發(fā)光。

3.2 加入中藥煎煮液的柵藻延遲發(fā)光測量

3.2.1中藥煎煮液的制備 精確稱量黃芩10 g, 置于煎煮鍋中，再添加200 mL水，浸泡藥材。30 min后，加熱煎煮鍋，定時15 min，功率2 200 w。液體加熱至沸騰后，功率轉為800 w，使用六層紗布過濾煎煮液。過濾后的煎煮液暫存于250 mL的燒杯中，將殘渣重新放回砂鍋中與新量取的200 mL水混合，煎煮方法同上。第二次過濾后將砂鍋內(nèi)的藥渣除凈，將兩次獲得的煎煮液混合后再次加入砂鍋中，使用電陶爐2 200 w功率加熱，煎煮液沸騰后改為800 w，濃縮至終體積50 mL(終濃度為0.2 g/mL)，轉入50 mL離心管并冷卻至室溫后，4 ℃保存(第二天使用)。

3.2.2中藥煎煮液的延遲發(fā)光測量 取100 μL中藥煎煮液上清，加入至柵藻混合液中，吹打混勻后，轉入YPMS-2生物光子測量儀的暗室內(nèi)，進行激發(fā)延遲發(fā)光的檢測。檢測方法同3.1節(jié)。

3.3 數(shù)據(jù)處理分析[8]

使用軟件Statistica 10.0處理延遲發(fā)光實驗數(shù)據(jù)，運用式 ( 1 ) 進行“雙曲”擬合，式 ( 2 ) 計算延遲發(fā)光平均強度(IW)，將IW與t進行線性擬合，得到相應的線性擬合方程。其中斜率K表征了柵藻在不同的液體環(huán)境中延遲發(fā)光的動力學演化行為，可表征樣品性質(zhì)。

I(t)=A×csch2(t/B+C)

(1)

IW=A×B/W×[cothC-coth (W/B+C)]

(2)

其中，A為強度參量，B為特征時間，C為位相因子，W為總的測量時間。

3.4 方法學考察

3.4.1儀器背景噪聲 實驗前后進行系統(tǒng)背景噪聲的測量，選擇背景測量，點間隔1 s，測量時間15 min，激發(fā)光源為White-LED，激發(fā)時間為10 s，連續(xù)測量10 d，實驗前后背景系統(tǒng)噪聲在一個光子差值內(nèi)，認為儀器系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)，儀器精密度良好。

3.4.2精密度實驗 取同一管黃芩煎煮液的上清按照3.2.2節(jié)方法連續(xù)進樣檢測7次，數(shù)據(jù)按照3.3節(jié)方法進行處理，若是7次試驗K值的RSD<4%，則精密度符合要求。

3.4.3重復性實驗 取同批次的黃芩7份，煎煮成藥液后，取上清，按照3.2.2節(jié)方法連續(xù)進樣檢測7次，數(shù)據(jù)按照3.3節(jié)方法進行處理，若是7次重復試驗K值的RSD<8%,則重復性符合要求。

3.4.4穩(wěn)定性實驗 取同一管中藥煎煮液的上清，按照3.2.2節(jié)方法分別在0、4、8、12、24、48、72 h進樣檢測，數(shù)據(jù)按照3.3節(jié)方法進行處理，若是7次試驗K值的RSD < 4%,則穩(wěn)定性符合要求。

3.4.5空白實驗 分別將空白溶劑(無菌水)100 μL和培養(yǎng)基BG11 100 μL加入到3 mL柵藻中，按照3.2.2節(jié)方法，連續(xù)進樣檢測7次，數(shù)據(jù)按照3.3節(jié)方法進行處理，若兩者K值無顯著性差異，表明空白溶劑對本實驗沒有干擾。

4 結果與討論

4.1 柵藻K值波動范圍測定

本研究通過測量柵藻作為生物指示劑使用時，其最佳生長階段 ( 41～60 d ) 內(nèi)的延遲發(fā)光數(shù)據(jù)，得到柵藻K值的波動范圍，利用生物光子的手段，對柵藻的生長狀態(tài)進行描述，并且優(yōu)化柵藻的可使用范圍。表1給出了不同批次的柵藻在41～60 d內(nèi)的7次激發(fā)延遲發(fā)光的平均強度對時間的線性方程及線性擬合斜率K。我們發(fā)現(xiàn)兩個批次的柵藻在20 d內(nèi)的激發(fā)延遲發(fā)光斜率K比較穩(wěn)定，波動較小，見圖1，批次1與批次2沒有顯著差異，見圖2，經(jīng)過計算可知多次測量的K值符合正態(tài)分布，其中ρ=0.181，μ=3.3488，所以，根據(jù)置信區(qū)間[μ-3ρ,μ+3ρ]，得到柵藻K值范圍為2.81～3.89。

表1 不同日期柵藻延遲發(fā)光K值對比

圖2第41～60d不同批次柵藻激發(fā)延遲發(fā)光的平均強度對測量時間的線性擬合斜率K值比較

Fig.2Comparison of theK-value of different Scenedesmuscerevisiae batches on the41st to60th day

4.2 方法學考察

4.2.1儀器背景噪聲 在實驗前后分別檢測儀器噪聲發(fā)現(xiàn)，實驗后的系統(tǒng)噪聲比實驗前的略小，實驗前噪聲平均值為10.68，實驗后噪聲平均值為10.04，相差不到1個光子，t檢驗結果發(fā)現(xiàn)并無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見圖3，因此認為儀器系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)。

圖3 連續(xù)10 d實驗前后儀器系統(tǒng)噪聲對比

4.2.2精密度實驗 本研究測定了7次同一黃芩煎煮液的激發(fā)延遲發(fā)光的平均強度對測量時間的線行擬合斜率K，見表2，經(jīng)計算其RSD≈3.78%。因為RSD<4%，故該檢測方法符合精密度要求。

表2 同一黃芩煎煮液擬合斜率KTable 2 The fitting slope K-value of the same scutellaria decoction

4.2.3重復性實驗 分別稱量相同批次的黃芩10 g，連續(xù)7 d對其煎煮液進行測定激發(fā)延遲發(fā)光的平均強度對測量時間的線行擬合斜率K，見表3。對結果進行計算，7次K值得出的RSD ≈ 3.835% ，因RSD < 8%，故該檢測方法符合重復性要求。

表3 同一批次黃芩煎煮液連續(xù)7 d的擬合斜率K

4.2.4穩(wěn)定性實驗 表4給出了生長階段的柵藻在0、4、8、12、24、48 h的7次激發(fā)延遲發(fā)光的平均強度對測量時間的線行擬合斜率K，經(jīng)過計算發(fā)現(xiàn)RSD ≈ 2.845%， 因RSD < 4%，故該檢測方法符合穩(wěn)定性實驗檢測標準。

表4 不同時間段激發(fā)延遲發(fā)光的平均強度對測量時間的先行擬合斜率K

4.2.5空白實驗 為了避免中藥煎煮液中的溶劑水對柵藻K值的影響，我們將加入空白溶劑水的柵藻作為對照組，將加入BG11培養(yǎng)基的柵藻作為空白組進行檢測，實驗結果表明，對照組與空白組之間無顯著性差異(P>0.05)，見圖4，說明了中藥煎煮液中的溶劑水并不影響中藥的藥性檢測。

圖4 空白溶劑 ( H2O ) 與BG11的K值對比

5 結論

中藥藥性是中醫(yī)藥基礎理論的重要組成內(nèi)容，建立符合現(xiàn)代科學認知規(guī)律的中藥藥性表征體系及其規(guī)范標準是中藥藥性理論研究的關鍵科學問題，而寒熱溫涼四性是藥性理論研究的重點之一[15]?；谏锕庾酉喔尚岳碚撆c中醫(yī)藥理論具有共同特征[16]，我們建立了以柵藻激發(fā)延遲發(fā)光的平均強度對測量時間的線性擬合斜率K定量化表征中藥藥性這一方法，符合中醫(yī)整體觀。

本研究進行了以柵藻作為生物指示劑表征中藥藥性的方法學驗證，探討了其儀器背景噪聲、精密度、穩(wěn)定性和重復性，并進行了空白實驗，優(yōu)化了柵藻的使用條件，獲得了柵藻K值的正常波動范圍為2.81～3.89，儀器適應性良好，連續(xù)10 d檢測結果并無統(tǒng)計學差異，精密度實驗RSD≈3.78% < 4%，重復性RSD≈3.835%<8%，穩(wěn)定性RSD≈2.845%<4%。因此，柵藻激發(fā)延遲發(fā)光的平均強度對測量時間的線性擬合斜率K定量化表征中藥藥性這一方法是符合方法學驗證要求。本研究建立的方法為中藥藥性的定量化研究提供了實驗基礎。