江津津，姚曉靜，歐愛芬，劉慧娟，陳烽華

(廣州城市職業(yè)學(xué)院 食品系，廣東 廣州 510405)

酶，是生物為了提高其生物化學(xué)的反應(yīng)效率而產(chǎn)生的高效生物催化劑。生物體內(nèi)，所有的反應(yīng)均在酶的催化下完成，而且選擇性極高[1]。多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，簡稱PPO)是自然界中分布極其廣泛的一類含銅氧化還原酶[2]，多酚氧化酶化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，并且普遍存在于植物、真菌、昆蟲等質(zhì)體中，甚至在土壤里腐爛殘敗的植物碎渣上都可以檢測到多酚氧化酶的活性[3]。由于其檢測方便，是被最早研究的幾類酶之一。中外許多研究者已對蝦類、果蔬和菌類中的多酚氧化酶的特性都進(jìn)行過大量研究，但是以墨魚囊為研究對象，提取純化并研究其墨囊中的多酚氧化酶，國內(nèi)外報(bào)道很少。隨著對多酚氧化酶的深入研究，發(fā)現(xiàn)其酶制劑可用于紅茶制造[4]。使用多酚氧化酶對茶飲料的品質(zhì)有一定的提高效果[5]，它可催化茶葉中的多酚類氧化生成醌類，后者進(jìn)一步聚合生成茶色素、茶多酚等與紅茶品質(zhì)的形成密切相關(guān)。茶色素是茶葉中多酚類與其氧化衍生物的混合物，主要成分為茶黃素類、茶紅素和茶褐素，不僅是紅茶湯色“亮”的主要成分，同時也是湯色強(qiáng)度和鮮爽度的重要因素，對紅茶色澤、香味以及口感等品質(zhì)起著決定性的作用。茶色素不僅可由紅茶提取而得到，還可以由多酚氧化酶發(fā)生酶促氧化而制得[6-7]。茶飲料加工就是利用酶具有的這種特性，用技術(shù)手段鈍化或激發(fā)酶的活性，使其沿著茶類所需的要求發(fā)生酶促反應(yīng)而獲得各類茶特有的色香味。目前用于茶飲料的PPO多為進(jìn)口的酶制劑，價格昂貴，成本高。如能從水產(chǎn)加工廢棄物中提取出天然高效的PPO,并應(yīng)用于紅茶加工，則經(jīng)濟(jì)效益可觀，并有利于水產(chǎn)資源的綜合利用。有研究者報(bào)道頭足類動物墨魚體內(nèi)的墨囊蘊(yùn)含有高效的PPO，墨魚墨囊為水產(chǎn)加工廢棄物，而且墨魚墨汁已被應(yīng)用于面條加工等食品，已被證實(shí)食用安全。開發(fā)新的可應(yīng)用于茶飲料生產(chǎn)的高效、經(jīng)濟(jì)的酶資源前景可觀，因此，墨魚墨多酚氧化酶具有良好的利用價值。隨著制茶工藝學(xué)的發(fā)展和各門科學(xué)技術(shù)的相互滲透，可以預(yù)見，天然墨魚墨多酚氧化酶應(yīng)用于紅茶飲料加工是很有前景的。

一、研究內(nèi)容

(一)墨魚墨囊中提取的多酚氧化酶及其特性

以墨魚墨囊為原料，溶于0.05mol/mL pH7.2磷酸鹽緩沖液中并冷凍離心提取，再經(jīng)過30%-80%硫酸銨分級沉淀，以多巴溶液為底物，利用紫外分光光度計(jì)測其在475nm處吸光度每分鐘的變化值，從而檢出其PPO酶活力。

(二)PPO應(yīng)用于紅茶飲料加工的工藝研究

把PPO添加到紅茶飲料中反應(yīng)后再進(jìn)行檢測。利用紫外分光光度計(jì)分別測得溶液在269nm、274nm、375nm處的紫外吸收值，從而反映茶色素，特別是茶黃素的生成情況，為PPO在茶飲料加工中的應(yīng)用工藝提供一份分析評價的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在添加酶濃度、溶液pH、反應(yīng)溫度三個單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，再進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，通過分析得到最優(yōu)工藝條件。最后通過感官評定測試最優(yōu)工藝條件下的產(chǎn)品與實(shí)際感官最優(yōu)產(chǎn)品是否一致。

二、材料與方法

(一)原料與儀器

云南鳳慶滇紅功夫紅茶，新鮮墨魚墨囊(廣州黃沙水產(chǎn)批發(fā)市場)，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，硫酸銨，左旋多巴(DL-DOPA)，以上試劑均為分析純。UV-1800PC紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)，高速臺式冷凍離心機(jī)(上海圣科儀器設(shè)備有限公司)，萬分之一天平(賽多利斯有限公司)，電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，精密pH計(jì)(上海雷磁有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

(二)方法

1.墨囊PPO的提取與酶活測定

PPO的提?。悍Q取墨魚墨50克，加200 mL 0.05mol/LpH7. 2的磷酸鈉緩沖液。溫和攪拌1小時，再將提取液于15000g冷凍離心機(jī)中離心30min，汲取上清液作為粗酶液。所有純化操作均在4℃條件下進(jìn)行。硫酸銨分級沉淀：根據(jù)粗酶液體積(mL)和(NH4)2SO4的飽和度常用表計(jì)算出要達(dá)到30%飽和度時所需的固體(NH4)2SO4粉末的量，稱量并研細(xì)后邊攪拌邊緩緩加入粗酶液中，靜置30分鐘，將溶液移入離心管中，15000g離心30分鐘。棄去沉淀，記錄上清液的體積。再次根據(jù)上清液的體積和(NH4)2SO4飽和度常用表計(jì)算達(dá)到40%飽和度需(NH4)2SO4的加入量，重復(fù)前述離心方法，直至達(dá)到80%硫酸銨飽和度沉淀分離結(jié)束。去除清液及其懸浮物，將沉淀溶于最小體積的0.05 mol/LpH7.2的磷酸緩沖液中。

PPO酶活力測定： 以2.98 mL的5mmol/L的配制在0.05 mol/LpH7.2的磷酸鈉緩沖液中的多巴 (D,L-3,4-二經(jīng)苯丙氨酸，Sigma公司) 溶液為底物，反應(yīng)池中加入0.02mL酶液混勻。參比池用 0.05 mol/L pH7. 2的磷酸鈉緩沖溶液代替酶液，其它條件均與反應(yīng)池相同。使用紫外可見分光光度計(jì)在波長475 nm處測定酶活力。記錄每分鐘引起A475nm變化0.001所需的酶量。

2.PPO應(yīng)用于茶飲料的研究

PPO在茶飲料加工中參與一系列酶促活動引起的化學(xué)變化。茶色素是從茶葉中提取的一類水溶性酚性色素，主要分為茶紅素、茶黃素和茶褐素。PPO的酶促氧化主要形成茶色素中的茶黃素，而茶黃素是紅茶湯色亮的主要成分，其含量愈高，茶飲料品質(zhì)愈好[8]。由此本研究主要以茶黃素生成情況來判定最優(yōu)工藝條件。茶黃素跟茶褐素在紫外波長270nm左右有吸收，其中茶黃素在波長272-275nm范圍內(nèi)有最大吸收，茶紅素、茶黃素和茶褐素在波長380nm處左右均有吸收。利用紫外分光光度計(jì)，通過以蒸餾水為對比，與參照樣分別在269nm、274nm和375nm處測定各樣品的紫外吸收值，通過吸收值高低來表征在墨魚墨PPO的作用下，茶色素的生成情況，再通過感官量化分析試驗(yàn)，結(jié)合消費(fèi)者的感官評價來確定墨魚墨PPO添加到紅茶飲料加工的最優(yōu)工藝參數(shù)。

3.正交實(shí)驗(yàn)方法

單因素實(shí)驗(yàn)：根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定較優(yōu)因素值,各個因素選取三個優(yōu)水平設(shè)計(jì)進(jìn)行下一步三因素三水平正交實(shí)驗(yàn),并進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。因素水平表如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

4.統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS12.0和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，差異性分析(ANOVA)被用來檢查各個不同結(jié)果的平均值間的顯著性差異，采用3個平行，取95%置信度(P<0.05)。

感官量化描述分析(QDA)：以云南鳳慶滇紅功夫紅茶為原料，通過純凈水浸泡和墨魚墨PPO酶加工，過濾得到浸提液，生產(chǎn)出編號為1-9的9個樣品，不同編號的樣品生產(chǎn)工藝條件對應(yīng)不同試驗(yàn)號，樣品號與試驗(yàn)號對應(yīng)。制作完9個樣品后進(jìn)行感官量化分析，本次感官評定選用8名評價員(2男6女) ，按照紅茶飲料的感官評定表(表2),按照顏色、滋味、香氣這三種感官對9個樣品進(jìn)行評分[9]，然后根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)制成雷達(dá)圖。

表2 紅茶飲料感官評定表

三、結(jié)果與分析

(一)墨魚墨PPO純化結(jié)果與分析

墨魚墨PPO提取純化結(jié)果如表3所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明墨魚墨囊中PPO酶活性很強(qiáng)，酶粗液經(jīng)過純化處理后，PPO酶活性大大提高。原來的粗酶液中PPO活性較低，經(jīng)硫酸銨分級沉淀后，活性提升較大，純化倍數(shù)提高了3.09。

(二)PPO應(yīng)用于紅茶飲料的結(jié)果與分析

1.單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

考慮PPO應(yīng)用到紅茶飲料加工的主要影響因素，根據(jù)參考文獻(xiàn)中外源酶在茶葉加工中的應(yīng)用方案設(shè)計(jì)了添加酶濃度(體積百分比)、根據(jù)PPO酶的特性設(shè)置了反應(yīng)溫度、pH三個因素的單因素實(shí)驗(yàn)(表1)。為正交試驗(yàn)做準(zhǔn)備，提供合理的數(shù)據(jù)范圍和參數(shù)。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1、圖2、圖3所示。

0.60.50.40.30.20.10吸光度A添加酶濃度/%0.020.040.060.080269nm274nm375nm

圖1 酶濃度對吸光度的影響

圖2 溫度對吸光度的影響

圖3 pH對吸光度的影響

由圖1可知PPO添加酶濃度體積百分比在0.01%、0.03%和0.05%最為合適，據(jù)文獻(xiàn)也與大多數(shù)多酚氧化酶作用于茶飲料加工的添加酶濃度相符[10]，當(dāng)添加酶濃度超過0.05%時曲線趨于平緩。由圖2可知反應(yīng)溫度在40℃、50℃和60℃最合適,溫度高于60℃時PPO活性下降迅速。由圖3可知，最適pH值在6.0,7.0和8.0,這個pH范圍也符合大多數(shù)多酚氧化酶的最適pH值。

2.正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)利用正交表來對試驗(yàn)進(jìn)行整體設(shè)計(jì)、比較兼統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)現(xiàn)通過少數(shù)的實(shí)驗(yàn)次數(shù)找到較好的生產(chǎn)條件，每次試驗(yàn)都具有較強(qiáng)的代表性，保證了整體實(shí)驗(yàn)的全面客觀性。而由圖1、圖2和圖3可知分別可選擇添加酶濃度0.01%、0.03%、0.05%，反應(yīng)溫度40℃、50℃、60℃和pH6.0、pH7.0、pH8.0進(jìn)行正交試驗(yàn)，對PPO在紅茶飲料加工工藝進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案，見表4。

表3 墨魚墨PPO純化結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

其中紫外吸收波長269nm處以K1、K2、K3、k1、k2、k3、R表示，274nm處以K1’、K2’、K3’、k1’、 k2’、 k3’、R’表示，375nm處則以K1”、K2”、K3”、k1”、 k2”、 k3”、R”表示。由表4可知，影響PPO作用生成茶色素的主次因素是B>A>C，即反應(yīng)溫度是最大的影響，其次是添加酶濃度，最后是溶液pH。對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析得出優(yōu)方案為A3B3C2，且優(yōu)方案與正交表中最好的第9試驗(yàn)A3B3C2一致，所以優(yōu)方案符合實(shí)際，即為添加酶濃度為0.05%，反應(yīng)溫度為60℃，pH值為7.0。

3.感官量化分析(QDA)結(jié)果與分析

感官評定實(shí)驗(yàn)是食品的研究開發(fā)過程主要用來分析評價食品的質(zhì)量特性的方法，本實(shí)驗(yàn)評定了添加了PPO的紅茶飲料的感官特性，制得的紅茶樣品如圖4所示。

圖4 添加了PPO的紅茶樣品

由感官評定小組按照顏色，滋味，香氣這三種進(jìn)行感官評分，感官評分越高代表產(chǎn)品感官更趨于消費(fèi)者接受，將感官評價員的最終評分進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，制成了雷達(dá)圖，結(jié)果如圖5所示。

圖5 樣品感官評分雷達(dá)圖

由圖5可直觀看出，樣品9無論顏色、滋味和香氣的感官評分都是最高的，故可判斷樣品9對應(yīng)的試驗(yàn)9的方案為最優(yōu)工藝條件，同時驗(yàn)證了最佳工藝條件為：添加PPO酶的濃度為0.05%，反應(yīng)溫度為60℃，反應(yīng)體系pH值為7。

四、結(jié)論

(1)從墨魚墨囊中用緩沖溶液浸提所得到的多酚氧化酶PPO粗酶液，經(jīng)30%-80%硫酸銨分級沉淀后其酶活性比原來提高了3.09倍，酶活性達(dá)到199450u?？梢娔~加工廢棄物墨囊中含有高活性的PPO，可用于茶飲料的加工。

(2)不同工藝參數(shù)條件下，以各樣品在269nm、274nm和375nm(茶褐素269nm、茶黃素274nm、茶黃素和茶紅素375nm)處測定的紫外吸收值為茶色素含量評價指標(biāo)，通過單因素和正交試驗(yàn)，確定添加酶濃度0.05%，溫度60℃和pH值為7.0是墨魚墨PPO在紅茶飲料中產(chǎn)生茶色素的最佳工藝條件。

(3)通過QDA分析，驗(yàn)證了添加酶濃度0.05%，溫度60℃和pH值為7.0是墨魚墨PPO用于紅茶加工產(chǎn)生茶色素的最佳工藝條件，該條件下加工的紅茶飲料顏色最為紅艷透亮，滋味濃醇鮮爽而且澀味柔和，香氣濃郁。

五、思考與展望

本研究發(fā)現(xiàn)，墨魚墨囊中含有高活性的PPO，且提取純化方法簡單易行，能作為高效、經(jīng)濟(jì)的天然酶資源應(yīng)用于茶飲料的生產(chǎn)加工，對推動我國茶飲料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有很大幫助。水產(chǎn)廢棄物墨魚墨的重新利用，達(dá)到了變廢為寶的目的，為建立資源節(jié)約型和環(huán)境友好型社會做出很大貢獻(xiàn)。經(jīng)試驗(yàn)證明，墨魚墨多酚氧化酶應(yīng)用于紅茶飲料加工中，能有效地提高茶色素特別是茶黃素的含量，不僅使紅茶的感官品質(zhì)、保健功效得到大大提高，也把廢物利用的觀念提高到了一個全新的高度，實(shí)現(xiàn)生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會效益的相統(tǒng)一，因此墨魚墨囊多酚氧化酶在茶飲料加工中具有廣闊的應(yīng)用前景。