欒仲秋

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

糖尿病腎病是腎臟細(xì)胞外基質(zhì)的異常積累導(dǎo)致腎小球硬化，最終出現(xiàn)糖尿病微血管并發(fā)癥[1].腎小球系膜細(xì)胞是腎小球疾病中的主要靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，是糖尿病腎病病理改變的基礎(chǔ)[2].藥用黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，是腎臟疾病治療的常用中藥[3].研究[4]發(fā)現(xiàn)：黃芪總苷具有降血糖、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種作用.異黃芪皂苷Ⅳ是從黃芪總苷中分離得到的單體化合物，是其發(fā)揮藥效的主要活性成分[5].本研究在體外模擬高糖環(huán)境中的人腎小球系膜細(xì)胞，觀察異黃芪皂苷Ⅳ對(duì)高糖處理的人腎小球系膜細(xì)胞中Ⅳ型膠原、活性氧、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、p-Smad2/3、NADPH氧化酶4、瞬時(shí)受體電位陽離子通道蛋白6(TRPC6)表達(dá)的影響，探討異黃芪皂苷Ⅳ在糖尿病腎病防治中的作用及相關(guān)機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人腎小球系膜細(xì)胞HRMC(上海晶抗生物工程有限公司)；異黃芪皂苷Ⅳ(成都曼思特生物科技有限公司)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(博奧賽斯(天津)生物科技有限公司)；CCK-8試劑、Trizol試劑、Ⅳ型膠原酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(廣州康盛生物科技股份有限公司)；DCFH-DA試劑盒(上海銳賽生物技術(shù)有限公司)；鼠抗人TGF-β1單克隆抗體(1∶300)、兔抗人p-Smad2/3多克隆抗體(1∶500)、兔抗人NADPH氧化酶4多克隆抗體(1∶500)、鼠抗人TRPC6單克隆抗體(1∶500)、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、HRP標(biāo)記的二抗(泛柯(上海)生物科技有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

常規(guī)復(fù)蘇HRMC后使用胰蛋白酶消化傳代，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中.將細(xì)胞分為7組：正常對(duì)照組(5.6 mmol/L 葡萄糖)，高糖模型組(30 mmol/L葡萄糖)，Tempol陽性對(duì)照組(100 μmol/L Tempol+30 mmol/L葡萄糖)，Ly364947陽性對(duì)照組(10 μmol/L TGF-β阻斷劑Ly364947+30 mmol/L葡萄糖)，異黃芪皂苷Ⅳ低濃度組(30 μmol/L異黃芪皂苷Ⅳ+30 mmol/L葡萄糖)，異黃芪皂苷Ⅳ中濃度組(60 μmol/L異黃芪皂苷Ⅳ+30 mmol/L葡萄糖)，異黃芪皂苷Ⅳ高濃度組(120 μmol/L異黃芪皂苷Ⅳ+30 mmol/L葡萄糖).

1.2.2 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶-EDTA消化液處理后，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1×105/孔密切接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔.37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，在每孔中加入10 μL CCK-8試劑，避光，37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀讀取490 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度OD值.

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原含量

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶-EDTA消化液處理后，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1×106/孔密切接種于24孔板中.37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸去各培養(yǎng)孔上清液，加入無胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使各培養(yǎng)孔中細(xì)胞同步，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔.培養(yǎng)48 h后收集各培養(yǎng)孔細(xì)胞上清液，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定Ⅳ型膠原含量，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行.

1.2.4 DCFH-DA熒光染色測(cè)定細(xì)胞中活性氧水平

細(xì)胞培養(yǎng)同1.2.3，培養(yǎng)48 h后吸去培養(yǎng)液，加入含10 μmmol/L DCFH-DA無胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基1 mL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，充分洗去未進(jìn)入細(xì)胞中的DCFH-DA，熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，應(yīng)用Ipp圖像分析軟件測(cè)量綠色熒光強(qiáng)度OD值.

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中TGF-β1、p-Smad2/3、NADPH氧化酶4、TRPC6蛋白表達(dá)

細(xì)胞中加入蛋白裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，分離上清，BCA法蛋白定量，取30 μg行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離得到的目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下封閉1 h.滴加鼠抗人TGF-β1單克隆抗體(1∶300)、兔抗人p-Smad2/3多克隆抗體(1∶500)、兔抗人NADPH氧化酶4多克隆抗體(1∶500)、鼠抗人TRPC6單克隆抗體(1∶500)、鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜，滴加HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，ECL顯色，Image J 分析各條帶灰度值.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 異黃芪皂苷Ⅳ對(duì)高糖誘導(dǎo)HRMC增殖的影響

培養(yǎng)48 h后，高糖模型組細(xì)胞增殖水平明顯高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示高糖有促進(jìn)HRMC增殖的作用.與高糖模型組比較，隨著異黃芪皂苷Ⅳ濃度的增加，給藥組的HRMC增殖水平依次降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Tempol陽性對(duì)照組、Ly364947陽性對(duì)照組HRMC增殖水平明顯低于高糖模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).見表1.

2.2 異黃芪皂苷Ⅳ對(duì)高糖誘導(dǎo)HRMC Ⅳ型膠原含量的影響

培養(yǎng)48 h后，各培養(yǎng)孔細(xì)胞上清液中均有Ⅳ型膠原表達(dá)，高糖模型組Ⅳ型膠原含量明顯高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示高糖能夠刺激HRMC分泌Ⅳ型膠原.與高糖模型組比較，Tempol陽性對(duì)照組、Ly364947陽性對(duì)照組、各濃度異黃芪皂苷Ⅳ干預(yù)組的Ⅳ型膠原含量均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，異黃芪皂苷Ⅳ呈劑量依賴性降低HRMC上清液中Ⅳ型膠原表達(dá).見表2.

組別c/(μmol·L-1)n細(xì)胞增殖水平(OD值)正常對(duì)照組—50.583±0.029高糖模型組—50.861±0.046?Tempol陽性對(duì)照組10050.617±0.032#Ly364947陽性對(duì)照組1050.644±0.035#異黃芪皂苷Ⅳ低濃度組3050.758±0.051#異黃芪皂苷Ⅳ中濃度組6050.716±0.032#異黃芪皂苷Ⅳ高濃度組12050.635±0.056#

注：*.與正常對(duì)照組比較P<0.05；#.與高糖模型組比較P<0.05.

組別c/(μmol·L-1)nρ(Ⅳ型膠原含量)/(ng·mL-1)正常對(duì)照組—570.81±3.73高糖模型組—594.26±3.48?Tempol陽性對(duì)照組100573.72±2.64 #Ly364947陽性對(duì)照組10572.69±2.68 #異黃芪皂苷Ⅳ低濃度組30587.79±4.81#異黃芪皂苷Ⅳ中濃度組60577.36±2.70 #異黃芪皂苷Ⅳ高濃度組120573.85±2.53 #

注：*.與正常對(duì)照組比較P<0.05；#.與高糖模型組比較P<0.05.

2.3 異黃芪皂苷Ⅳ對(duì)高糖誘導(dǎo)HRMC活性氧含量的影響

高糖模型組細(xì)胞活性氧含量明顯高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示高糖能夠增強(qiáng)HRMC氧化應(yīng)激，使活性氧含量上升.與高糖模型組比較，Tempol陽性對(duì)照組、Ly364947陽性對(duì)照組、各濃度異黃芪皂苷Ⅳ干預(yù)組的細(xì)胞活性氧含量均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中異黃芪皂苷Ⅳ呈劑量依賴性降低細(xì)胞活性氧含量.見圖1、表3.

表3 培養(yǎng)48 h后各組HRMC活性氧熒光強(qiáng)度Tab.3 Reactive oxygen species fluorescence intensity of HRMC in each group after 48 h culture

注：*.與正常對(duì)照組比較P<0.05；#.與高糖模型組比較P<0.05.

2.4 各組HRMC中TGF-β1、p-Smad2/3、NADPH氧化酶4、TRPC6蛋白的表達(dá)水平

高糖模型組HRMC中TGF-β1、p-Smad2/3、NADPH氧化酶4蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，TRPC6蛋白表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高糖模型組比較，Tempol陽性對(duì)照組、Ly364947陽性對(duì)照組、各濃度異黃芪皂苷Ⅳ干預(yù)組的TGF-β1、p-Smad2/3、NADPH氧化酶4蛋白表達(dá)水平均明顯下降，TRPC6蛋白表達(dá)水平明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).見圖2、表4.

組別c/(μmol·L-1)TGF-β1p-Smad2/3NADPH氧化酶4TRPC6正常對(duì)照組—0.435±0.0560.562±0.0670.721±0.0731.184±0.069高糖模型組—0.923±0.032 ?0.974±0.060 ?1.185±0.068 ?0.681±0.062 ?Tempol陽性對(duì)照組1000.630±0.075 #0.631±0.078#0.829±0.071 #1.027±0.023 #Ly364947陽性對(duì)照組100.644±0.063#0.618±0.042#0.872±0.046 #0.976±0.042 #異黃芪皂苷Ⅳ低濃度組300.882±0.038 #0.859±0.051#0.985±0.030 #0.802±0.063 #異黃芪皂苷Ⅳ中濃度組600.770±0.061#0.725±0.059 #0.892±0.025#0.895±0.050#異黃芪皂苷Ⅳ高濃度組1200.629±0.045 #0.661±0.046 #0.806±0.029#0.993±0.054#

注：*.與正常對(duì)照組比較P<0.05；#.與高糖模型組比較P<0.05.

3 討 論

目前，糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，有研究[6]認(rèn)為，其發(fā)生與進(jìn)展受遺傳因素和相關(guān)獲得性危險(xiǎn)因子共同影響，并由體內(nèi)長(zhǎng)期高血糖引發(fā)的血流動(dòng)力學(xué)異常改變和代謝紊亂所造成的.本研究采用細(xì)胞學(xué)研究方法在體外建立HRMC高糖模型，模擬體內(nèi)高血糖環(huán)境.HRMC作為人體腎臟的固有細(xì)胞，在糖尿病腎病發(fā)病過程中具有重要地位[7]，本研究中，體外高糖培養(yǎng)48 h后，HRMC增殖水平明顯增加，活性氧含量及NADPH氧化酶4蛋白表達(dá)水平明顯提升.提示高糖環(huán)境中HRMC的增殖能力和氧化應(yīng)激作用明顯增強(qiáng)，氧化應(yīng)激增強(qiáng)不僅直接損傷腎臟組織和細(xì)胞，還能夠激活多種糖尿病相關(guān)的細(xì)胞因子和分子通路，其中包括多元醇代謝通路、TGF-β信號(hào)通路等[8].

研究[9]發(fā)現(xiàn)：TGF-β1是糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，能夠參與胞外基質(zhì)的積累、腎小管間質(zhì)瘢痕硬化、腎小球硬化等過程.Smad蛋白作為TGF-β受體的細(xì)胞內(nèi)激酶底物，參與TGF-β信號(hào)通路的傳導(dǎo)，其中以Smad2/3作用最明顯，Smad2/3激活后生成的p-Smad2/3發(fā)揮著生物學(xué)作用[10-11].本研究中高糖培養(yǎng)48 h后，HRMC中TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達(dá)水平明顯提升，說明TGF-β1/Smad信號(hào)通路被激活，進(jìn)而促進(jìn)HRMC分泌Ⅳ型膠原，導(dǎo)致細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原含量增加.蛋白尿是糖尿病腎病發(fā)病早期的主要病理特征，在促進(jìn)病情發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用.研究[12]發(fā)現(xiàn)：TRP信號(hào)通路介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流在腎臟病變?cè)缙诟邽V過引發(fā)的蛋白尿中發(fā)揮著重要作用.TRPC6是一種非選擇性的陽離子信號(hào)通路蛋白，屬于TRP陽離子通道蛋白超家族.已有研究[13]在高糖誘導(dǎo)的腎小球細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了TRPC6蛋白表達(dá)水平下調(diào)能夠促進(jìn)鈣離子內(nèi)流，引發(fā)蛋白尿.目前關(guān)于高糖誘導(dǎo)的TRPC6異常表達(dá)的機(jī)制仍未完全明確，需進(jìn)一步深入研究.

黃芪對(duì)糖尿病腎病損傷的治療作用已有較多研究報(bào)道[14-15]，但具體作用機(jī)制仍未明確.為進(jìn)一步闡明異黃芪皂苷Ⅳ在糖尿病腎病防治中的作用機(jī)制，本研究分別使用抗氧化劑Tempol和TGF-β特異性阻斷劑Ly364947作為陽性對(duì)照，結(jié)果顯示：Tempol陽性對(duì)照組、Ly364947陽性對(duì)照組、各濃度異黃芪皂苷Ⅳ干預(yù)組對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMC增殖均有明顯的抑制作用，且能夠明顯提升HRMC的抗氧化能力，降低Ⅳ型膠原含量，下調(diào)TGF-β1、p-Smad2/3、NADPH氧化酶4蛋白表達(dá)，上調(diào)TRPC6蛋白表達(dá)，且隨著異黃芪皂苷Ⅳ濃度的增加，上述作用逐漸增強(qiáng).提示活性氧與TGF-β1在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展過程中具有協(xié)同作用，異黃芪皂苷Ⅳ能夠同時(shí)作用于活性氧、TGF-β1，提升HRMC中TRPC6蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮保護(hù)HRMC的作用.