唐偉智，侯恩存，唐友明，鄭景輝，吳競(jìng)，謝俊宇

在我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率中，原發(fā)性肝癌位列第三，僅次于肺癌和胃癌，其死亡率僅次于肺癌并逐漸上升［1-2］。原發(fā)性肝癌的非手術(shù)治療方式主要包括放化療、介入及生物靶向治療［3］。經(jīng)過(guò)近年來(lái)的臨床使用發(fā)現(xiàn)，沙利度胺可通過(guò)抑制血管生成、調(diào)節(jié)免疫、誘導(dǎo)凋亡等方面的作用治療實(shí)體腫瘤［4］。沙利度胺在臨床使用單藥維持，聯(lián)合放、化療，及聯(lián)合肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（TACE）治療肝癌的研究中均有報(bào)道沙利度胺的有效性。一項(xiàng)回顧性分析結(jié)果顯示［5］，53例使用沙利度胺治療的晚期肝癌病人，6例緩解，疾病控制15例，中位生存期10.5月，1年生存率為45%，2年為20%，且沒(méi)有發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)的病人。兩篇薈萃分析結(jié)果顯示TACE聯(lián)合沙利度胺治療肝癌的臨床療效優(yōu)于單純TACE［6-7］。但沙利度胺治療肝癌的有效性仍存在爭(zhēng)議，一項(xiàng)病案報(bào)道發(fā)現(xiàn)，沙利度胺聯(lián)合賽庚啶治療肝細(xì)胞肝癌的病人在停用沙利度胺后的近一年時(shí)間內(nèi)仍能維持肝腫瘤和肺轉(zhuǎn)移完全緩解［8］。Woo K等［9］一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，沙利度胺不能用于抗肝癌治療，但它的衍生物因能誘導(dǎo)生長(zhǎng)停滯、選擇性地誘導(dǎo)致瘤性肝祖細(xì)胞的凋亡而具有抗腫瘤藥物的潛力。故沙利度胺治療肝癌的療效及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

本研究起止時(shí)間為2018年6—12月，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接的角度研究沙利度胺治療原發(fā)性肝癌的可能作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于“藥物-靶點(diǎn)-基因-疾病”原理的相互作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)和影響系統(tǒng)綜合的觀察［10］。分子對(duì)接則是通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬配體置于受體的結(jié)合區(qū)域，即“鎖-鑰原理”，計(jì)算預(yù)測(cè)兩者間的結(jié)合親和性，進(jìn)而闡明藥物作用機(jī)制［11］。

1 材料與方法

1.1 靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)查詢沙利度胺的分子結(jié)構(gòu)，保存為Smiles格式。Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)可以根據(jù)二維和三維相似性度量與已知配體的組合，精確預(yù)測(cè)生物活性分子的目標(biāo)［12］。將沙利度胺的分子Smiles結(jié)構(gòu)導(dǎo)入該數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)的靶點(diǎn)信息。通過(guò)CTD、GeneCards及Liverome數(shù)據(jù)庫(kù)收集與原發(fā)性肝癌（Liver Neoplasms）相關(guān)的靶點(diǎn)，篩選出三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共有的基因，與沙利度胺相關(guān)靶點(diǎn)相映射，獲得沙利度胺治療原發(fā)性肝癌的潛在作用靶點(diǎn)。并利用DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)［13］分析靶點(diǎn)類型。

1.2 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將沙利度胺的潛在作用靶點(diǎn)通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)［14］進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析，分析結(jié)果網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖使用Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行可視化，每一個(gè)節(jié)點(diǎn)（Node）對(duì)應(yīng)一個(gè)蛋白靶點(diǎn)。使用軟件中插件Network Analyzer進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，節(jié)點(diǎn)的度值（Degree）大小代表該蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的重要性，根據(jù)Degree大小設(shè)置節(jié)點(diǎn)的顏色。

1.3 基因本體論（Gene Ontology，GO）分析DAVID在線生物數(shù)據(jù)分析工具可以提供來(lái)自基因組研究的大量基因的功能解釋，提供典型的基因術(shù)語(yǔ)富集分析［15］。將沙利度胺治療原發(fā)性肝癌的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID，研究物種限定為人類，GO分析內(nèi)容選擇生物進(jìn)程（BP）、細(xì)胞組成（CC）和分子功能（MF），這三個(gè)部分分析數(shù)據(jù)使用繪圖軟件Graphpad 7繪制成條形圖。

1.4 通路分析 京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）是一個(gè)基因組序列和其他高通量數(shù)據(jù)的生物學(xué)解釋的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)［16］，KEGGMapper是數(shù)據(jù)庫(kù)中用于KEGG映射的工具。將沙利度胺潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入KEGGMapper中，通路分析結(jié)果通過(guò)Omicshare數(shù)據(jù)庫(kù)繪制成氣泡圖，“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖通過(guò)Cytoscape軟件構(gòu)建。

1.5 分子對(duì)接 通過(guò)沙利度胺的結(jié)構(gòu)分子與潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。沙利度胺潛在作用靶點(diǎn)的PDB iD通過(guò)PDB（http：//www.rcsb.org/pdb/）查找。沙利度胺的分子結(jié)構(gòu)通過(guò)Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)下載保存為Mol2格式，導(dǎo)入到系統(tǒng)對(duì)接網(wǎng)站（Systems Dock Web Site）進(jìn)行在線分子與靶蛋白對(duì)接，預(yù)測(cè)其結(jié)合活性［17］?；贒ocK-IN評(píng)分，數(shù)值從0到10表示結(jié)合活性從弱到強(qiáng)，Score值＞7代表結(jié)合活性強(qiáng)烈，Score值＞5代表結(jié)合活性較好［15］。

2 結(jié)果

2.1 沙利度胺潛在作用靶點(diǎn) 將沙利度胺的Smiles格式導(dǎo)入Swiss Target Prediction，得到預(yù)測(cè)靶點(diǎn)15個(gè)。通過(guò)對(duì)CTD、GeneCards及Liverome數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索及整理，三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的共同肝癌靶點(diǎn)有5546個(gè)，與沙利度胺的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，最后得到11個(gè)沙利度胺治療原發(fā)性肝癌的潛在靶點(diǎn)（PTGS2、DPP4、DPP9、P2RX7、PARP1、MBNL1、MBNL2、MBNL3、MMP2、MMP9、MMP1）。將11個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果表明沙利度胺作用于原發(fā)性肝癌過(guò)程中主要涉及各種酶（氧化還原酶、水解酶、轉(zhuǎn)移酶、連接酶）。

2.2 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 將沙利度胺11個(gè)潛在作用靶點(diǎn)通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白互作分析，通過(guò)Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖可視化，見(jiàn)圖1。網(wǎng)絡(luò)中共有節(jié)點(diǎn)9個(gè)，邊10個(gè)，其中MBNL2、P2RX7不在該蛋白互作關(guān)系中。節(jié)點(diǎn)的顏色越深，代表該節(jié)點(diǎn)Degree值越大。網(wǎng)絡(luò)中degree值較大的靶蛋白為PTGS2、MMP9（degree值＝4），表示這些蛋白在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中較為重要，見(jiàn)表1。

圖1 沙利度胺的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.3 潛在作用靶點(diǎn)GO分析 圖2為沙利度胺治療原發(fā)性肝癌潛在靶點(diǎn)的GO分析結(jié)果，生物進(jìn)程主要為蛋白質(zhì)水解（5個(gè)靶點(diǎn)）。細(xì)胞組成主要為細(xì)胞核（7個(gè)靶點(diǎn)）、細(xì)胞外基質(zhì)（3個(gè)靶點(diǎn)）。分子功能主要為絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性、相同蛋白結(jié)合、多聚腺嘌呤核糖核苷酸結(jié)合及鋅離子結(jié)合（均為4個(gè)靶點(diǎn)）等。

表1 沙利度胺治療原發(fā)性肝癌潛在作用靶點(diǎn)信息

圖2 沙利度胺治療原發(fā)性肝癌潛在靶點(diǎn)的GO富集分析：A為生物進(jìn)程；B為細(xì)胞組成；C為分子功能（個(gè)）

2.4 潛在作用靶點(diǎn)代謝通路分析 基于KEGG通路分析，結(jié)果顯示11個(gè)沙利度胺治療原發(fā)性肝癌潛在作用靶點(diǎn)參與了41條通路，將富集程度（Rich Factor）前20的通路（P＜0.05）繪制成氣泡圖，其主要富集于癌癥通路（Pathways in cancer）、核因子κB信號(hào)通路（NF-kappa Bsignaling pathway）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路（VEGF signaling pathway）等通路。4條信號(hào)通路涉及4個(gè)靶點(diǎn)，分別為MMP1、MMP9、MMP2及PTGS2。表明沙利度胺治療原發(fā)性肝癌的潛在靶點(diǎn)分布于不同通路協(xié)調(diào)發(fā)揮作用。其“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖中，PTGS2、MMP-9的度值較大（Degree值分別為20、14），表明沙利度胺主要通過(guò)PTGS2、MMP-9作用于各種通路。

2.5 分子對(duì)接分析 將沙利度胺與11個(gè)靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示，沙利度胺分子與除MBNL2外的10個(gè)靶蛋白有良好的相互作用，見(jiàn)表2。結(jié)果表明了預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的可靠性。

表2 沙利度胺與靶點(diǎn)的分子對(duì)接得分

3 討論

本研究通過(guò)預(yù)測(cè)沙利度胺的相關(guān)靶點(diǎn)，整合CTD、GeneCards及Liverome數(shù)據(jù)庫(kù)中的原發(fā)性肝癌相關(guān)靶點(diǎn)，最后獲取沙利度胺治療原發(fā)性肝癌的11個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，主要由氧化還原酶、水解酶、轉(zhuǎn)移酶、連接酶等各種酶參與。其中，COX-2（PTGS2）在肝細(xì)胞中的高表達(dá)可通過(guò)減少TET1，沉默腫瘤抑制基因和激活關(guān)鍵的致癌途徑誘導(dǎo)啟動(dòng)子甲基化來(lái)誘導(dǎo)肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生［18］。而沙利度胺具有良好的環(huán)氧化酶抑制活性［19］。有研究報(bào)道［20］，沙利度胺可抑制 metalloproteinase-9（MMP-9）的活性，抑制MMP-9有助于褪黑素預(yù)防HepG2肝癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲性［21］。沙利度胺亦可抑制MMP-1和MMP-2的活性［20-22］。

通過(guò)GO分析，結(jié)果顯示沙利度胺的潛在作用靶點(diǎn)主要涉及生物進(jìn)程的蛋白質(zhì)水解及分子功能的絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性、相同蛋白結(jié)合、多聚腺嘌呤核糖核苷酸結(jié)合和鋅離子結(jié)合。這些生物過(guò)程與維持細(xì)胞正常的生理功能相關(guān)［23-24］，表明沙利度胺可參與調(diào)節(jié)多種生物過(guò)程治療原發(fā)性肝癌。

基于KEGG通路分析，沙利度胺潛在靶點(diǎn)的代謝通路主要富集于癌癥通路、核因子κB信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路等通路。NF-κB是一種可以參與炎癥、細(xì)胞增殖和凋亡的轉(zhuǎn)錄因子［25］，研究表明［26］，NK-κB在肝癌肝內(nèi)血管侵犯轉(zhuǎn)移相關(guān)。TNF-α是一種多效性炎性細(xì)胞因子，炎癥誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性CD8+T淋巴細(xì)胞活化抑制作為腫瘤發(fā)展的重要機(jī)制，超過(guò)90%的肝細(xì)胞肝癌在肝損傷和炎癥的情況下出現(xiàn)［27-28］。TNF-α的陽(yáng)性表達(dá)亦對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用［26］。推測(cè)沙利度胺通過(guò)抑制NF-κB通路及其對(duì)TNF-α表達(dá)的誘導(dǎo)發(fā)揮治療肝癌的作用，該作用與文獻(xiàn)報(bào)道相符［29］。

癌癥的主要標(biāo)志之一是誘導(dǎo)血管生成，新生血管的生長(zhǎng)可向惡性細(xì)胞提供充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是胚胎、成人生理和病理過(guò)程中血管生成的主要驅(qū)動(dòng)因子［30］。在腫瘤的持續(xù)生長(zhǎng)過(guò)程中，腫瘤內(nèi)部發(fā)生缺氧使VEGF的表達(dá)增加，促進(jìn)腫瘤邊緣部位形成新的血管［31］。研究表明［32-33］，沙利度胺可顯著減少人血清中VEGF的水平。推測(cè)沙利度胺在VEGF信號(hào)通路中通過(guò)抑制VEGF表達(dá)發(fā)揮抗血管生成從而治療原發(fā)性肝癌的作用。沙利度胺抗血管生成作用與文獻(xiàn)報(bào)道相符［34］。

沙利度胺通過(guò)調(diào)控多通路協(xié)調(diào)發(fā)揮治療原發(fā)性肝癌的效果，文獻(xiàn)報(bào)道與本研究相關(guān)通路分析相符，因此預(yù)測(cè)的結(jié)果具有一定的可靠性。沙利度胺治療原發(fā)性肝癌的通過(guò)作用于11個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，參與調(diào)控多條通路，表明了沙利度胺可通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路途徑治療原發(fā)性肝癌的特點(diǎn)。