全彥妮，王宜軒，李艷萍

·新型冠狀病毒專(zhuān)欄·

人冠狀病毒治療藥物研究進(jìn)展

全彥妮，王宜軒，李艷萍

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院抗病毒藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

冠狀病毒（coronaviruses，CoVs）是人畜共患病毒，廣泛存在于自然界，最早從鼠身上分離得到。因?yàn)榇蠖嘣诩倚蟆ⅧB(niǎo)禽等脊椎動(dòng)物間傳播，主要會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)造成明顯影響[1-2]。動(dòng)物冠狀病毒進(jìn)化后實(shí)現(xiàn)跨物種傳播，感染人導(dǎo)致人冠狀病毒（human coronavirus，HCoV）的出現(xiàn)[3]。較早出現(xiàn)的人冠狀病毒如 HCoV-229E 和 OC43 病毒感染癥狀較輕，一般表現(xiàn)為類(lèi)似感冒的上呼吸道感染，且多數(shù)能自愈，藥物研究也較少，未被人類(lèi)重視[4-5]。然而在近二十年，陸續(xù)出現(xiàn)了多種新型人冠狀病毒，而且傳染力和致病力明顯增強(qiáng)，病毒感染導(dǎo)致的嚴(yán)重下呼吸道疾病對(duì)患者生命健康構(gòu)成了巨大威脅。2003 年的嚴(yán)重急性呼吸窘迫綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）疫情導(dǎo)致全球 20 多個(gè)國(guó)家共計(jì)8000 多病例報(bào)告和 10% 的死亡率，中東呼吸綜合征（Middle East respiratory syndrome，MERS）死亡率更是高達(dá) 30%，而我國(guó)武漢暴發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）疫情自 2019 年 12 月發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)導(dǎo)致了超過(guò)三十萬(wàn)的全球確診病例。遺憾的是，到目前為止，針對(duì)這些高致病力病毒還沒(méi)有明確有效的疫苗或特異性抗病毒藥物上市。突發(fā)的疫情一次次刷新人類(lèi)對(duì)于冠狀病毒的了解和態(tài)度，也推動(dòng)了冠狀病毒預(yù)防和治療方法的研究進(jìn)度。本文對(duì)現(xiàn)有冠狀病毒藥物研究文獻(xiàn)進(jìn)行梳理，希望能夠?yàn)橥话l(fā)性人冠狀病毒感染治療藥物研究提供思路。

1 冠狀病毒生物學(xué)特征

CoVs 是一類(lèi)有包膜的正性單鏈 RNA 病毒，病毒顆粒直徑 80 ~ 120 nm，其結(jié)構(gòu)由外到內(nèi)依次為：刺突、外膜、包膜、衣殼、基因組。從膜表面伸出的刺突使病毒表面近似王冠，因而得名冠狀病毒[6]。冠狀病毒基因組長(zhǎng)度為 26 ~32 kb，5' 端有兩個(gè)重疊的開(kāi)放讀碼框 ORF1a 和 ORF1b，編碼兩個(gè)復(fù)制酶多蛋白前體 pp1a 和 pp1ab，在多蛋白 pp1ab 中含有蛋白酶，能夠?qū)⒍嗟鞍浊绑w裂解為生成新病毒顆粒必需的一系列非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural protein，nps）；而剩余的讀碼框則編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白，包括刺突糖蛋白（spike glycoprotein，S）、膜蛋白（membrane protein，M）、包膜蛋白（envelop protein，E）和核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）以及病毒復(fù)制輔助蛋白。國(guó)際病毒委員會(huì)的 2018 版病毒分類(lèi)將冠狀病毒暫歸為 α、β、γ 和 δ-四個(gè)屬，近40 個(gè)毒種。其中感染人的冠狀病毒共有 6 種（HCoV-229E、OC43、NL63、HKU1、SARS-CoV 和 MERS-CoV）（表 1）。加上我國(guó) 2019 年 12 月新出現(xiàn)的 SARS-CoV-2 病毒，目前發(fā)現(xiàn)的人冠狀病毒共有 7 種。除 HCoV-229E 和 NL63 屬于 α 冠狀病毒屬外，其他 5 種人冠狀病毒均屬于 β 冠狀病毒屬。

冠狀病毒的生命周期可以分為病毒進(jìn)入、病毒復(fù)制和蛋白合成、組裝和出胞釋放等基本步驟。在病毒進(jìn)入的過(guò)程中，刺突糖蛋白 S 發(fā)揮著重要作用。S 蛋白的兩個(gè)亞單位 S1 和 S2 分別負(fù)責(zé)與細(xì)胞受體結(jié)合以及病毒與細(xì)胞膜融合，二者協(xié)同介導(dǎo)病毒與細(xì)胞表面受體結(jié)合，啟動(dòng)病毒 S 蛋白構(gòu)象變化，完成內(nèi)化和病毒進(jìn)入；同時(shí)，宿主半胱氨酸組織蛋白酶和跨膜絲氨酸蛋白酶（transmembrane protease serines，TMPRRS）已經(jīng)被證實(shí)參與介導(dǎo)病毒進(jìn)入過(guò)程中S 蛋白水解和完成膜融合的過(guò)程；病毒進(jìn)入細(xì)胞后，多蛋白前體在胞漿中被蛋白酶（chymotrypsin-like protease，3CLpro和 papain-like protease，PLpro）裂解生成功能性非結(jié)構(gòu)蛋白，催化病毒基因組復(fù)制和蛋白合成，在病毒的十余個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白中，目前只對(duì)依賴(lài) RNA 的 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerse，RdRp）、解旋酶和外切核糖核酸酶的功能有了較為明確的認(rèn)識(shí)，大部分非結(jié)構(gòu)蛋白的功能還并不清楚；最后病毒蛋白和基因組 RNA 整合成新的病毒顆粒，通過(guò)芽生或胞吐的方式排出，這兩個(gè)環(huán)節(jié)的具體機(jī)制也研究較少。

表 1 目前已證實(shí)的人冠狀病毒

2 冠狀病毒感染治療藥物研究

雖然冠狀病毒發(fā)現(xiàn)時(shí)間早，種類(lèi)多樣，但針對(duì)人冠狀病毒的研究是從 SARS 病毒出現(xiàn)后才得到越來(lái)越多的關(guān)注。目前的文獻(xiàn)報(bào)道中，大部分是針對(duì) SARS 或 MERS 等高致病病毒的研究結(jié)果。而且，多數(shù)抗病毒化合物都是源自對(duì)已上市藥物或生物活性化合物庫(kù)的高通量篩選。在病毒蛋白結(jié)晶結(jié)構(gòu)得到證實(shí)之后，全新藥物設(shè)計(jì)開(kāi)始嶄露頭角。在病毒的整個(gè)生命周期中，每一個(gè)環(huán)節(jié)以及參與其中發(fā)揮作用的功能蛋白都可能成為研發(fā)抗病毒藥物的靶點(diǎn)。因此，本文首先把目前文獻(xiàn)結(jié)果依據(jù)所針對(duì)的病毒生命周期中的不同環(huán)節(jié)進(jìn)行分類(lèi)，然后再細(xì)化描述每類(lèi)藥物中涉及的作用靶點(diǎn)及相關(guān)藥物研究進(jìn)展；同時(shí)補(bǔ)充分析機(jī)制不明確的抗病毒活性化合物，但對(duì)完全虛擬篩選的研究結(jié)果不做討論。

2.1 病毒進(jìn)入抑制劑

2.1.1 靶向刺突蛋白與受體相互作用的抗體藥物 S 蛋白具有免疫原性，能夠誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)，因此，作為抗體藥物研究靶點(diǎn)受到一定關(guān)注。公開(kāi)的文獻(xiàn)報(bào)道大部分是以 SARS 或 MERS 病毒 S 蛋白的特定序列或相應(yīng)細(xì)胞受體的部分結(jié)合區(qū)域作為抗原表位開(kāi)發(fā)的單克隆抗體，這類(lèi)抗體能夠直接中和病毒或者通過(guò)阻止刺突蛋白與細(xì)胞受體結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)預(yù)防或治療病毒感染[7-8]。多個(gè)單抗藥物已經(jīng)在動(dòng)物模型上被證實(shí)具有強(qiáng)病毒中和活性，比如抗 MERS 病毒的 m336，作為預(yù)防用藥能夠降低兔體內(nèi)病毒滴度達(dá)到 40 ~ 9000 倍[9]，還有研究表明，當(dāng)靶向 S 蛋白 HR1 結(jié)構(gòu)域的多肽 HR2P-M2 與 m336 聯(lián)合使用時(shí)，其抗 MERS-CoV 活性比單藥使用時(shí)更高[10]。我國(guó)科學(xué)家從 MERS 恢復(fù)者血漿中提取得到的單克隆抗體 MCA1能夠阻斷病毒與細(xì)胞受體 DPP4 之間的相互作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示其不僅明顯改善了病毒感染動(dòng)物的肺部病理，而且完全抑制了猴體內(nèi) MERS 病毒的復(fù)制[11]。另外，兩個(gè)靶向病毒 S 蛋白受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD）表位的單克隆抗體 REGN3051 和 3048 不僅在動(dòng)物模型上顯示出對(duì) MERS 病毒的預(yù)防和治療效果，并且已經(jīng)完成 I 期臨床研究[12]。Luke 等[13]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多克隆抗體 SAB-301 能使 MERS-CoV 感染的 Ad5-hDPP4 受體轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠的肺病毒滴度接近或低于檢測(cè)極限。由于不同冠狀病毒 S1 上與受體結(jié)合的基因差異，導(dǎo)致靶向 S 蛋白 S1 受體結(jié)合域 RBD 的抗體藥物也會(huì)不同，因此以 RBD 區(qū)域設(shè)計(jì)的抗體藥物不具有廣譜應(yīng)用的特性[14]。Wrapp 等[15]也證實(shí)靶向 SARS 病毒RBD 的三種單克隆抗體（S230、m396 和 80R）與新型冠狀病毒 SARS-CoV-2 之間缺乏交叉反應(yīng)活性。因此，對(duì)于新出現(xiàn)的突發(fā)冠狀病毒，基于刺突蛋白的治療抗體需要依靠分離自身病毒來(lái)制備。

2.1.2 刺突蛋白與宿主細(xì)胞受體結(jié)合抑制劑 不同冠狀病毒刺突蛋白的 S1 上 RBD 差異大，因此通過(guò)識(shí)別不同的宿主細(xì)胞膜受體并發(fā)生相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)病毒穿入（表 1）[16]。HCoV-NL63、SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的 S 蛋白均結(jié)合人表皮細(xì)胞膜上的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）；MERS 病毒和 229E 病毒的細(xì)胞表面受體分別是二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP-4）和氨肽酶N（APN）；而 HCoV-OC43 和 HKU1 的 S 蛋白則通過(guò)結(jié)合 O-乙酰唾液酸來(lái)啟動(dòng)進(jìn)入[17-21]。這類(lèi)病毒-宿主相互作用闡釋也促進(jìn)了治療藥物的發(fā)現(xiàn)研究。Kao 等[22]發(fā)現(xiàn)VE607（1，圖 1）能夠阻斷 SARS-CoV 的 S 蛋白與 ACE2 結(jié)合介導(dǎo)的病毒進(jìn)入，其抑制 SARS-CoV 的 EC50值為 1.6 μmol/L。SARS-CoV-2 與 SARS 病毒類(lèi)似，也是利用 ACE2 實(shí)現(xiàn)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞[23]。而且，最新 SPR（surface plasmon resonance）實(shí)驗(yàn)研究顯示，新病毒的S 蛋白與 ACE2 的親和力是 SARS 病毒的 10 ~ 20 倍[15]。研究者發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)離子衍生殼聚糖聚合物 HTCC （N-(2-hydroxypropyl)-3-trimethylammonium chitosan chloride， 2，圖 1）及其疏水衍生物能夠與刺突蛋白結(jié)合，從而阻止冠狀病毒 NL63 與細(xì)胞受體 ACE2 的相互作用而產(chǎn)生抑制病毒復(fù)制的活性，通過(guò) CPE 方法測(cè)定HTCC 抑制 NL63 病毒復(fù)制的 IC50為 10 μg/ml[24]。而且 HTCC 不同聚合物對(duì)幾種低致病力冠狀病毒（冠狀病毒 OC43、229E 和 HKU1）分別顯示出體外抗病毒活性[25]。

2.1.3 肽類(lèi)病毒融合抑制劑 冠狀病毒刺突蛋白是一個(gè)病毒融合蛋白，其被酶水解切割后生成 S1 和 S2 兩個(gè)亞單位。S1 亞單位上的 RBD 與受體結(jié)合后，S2 亞單位負(fù)責(zé)介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜的融合。研究顯示，在 SARS 病毒刺突蛋白 S2 上含有兩個(gè)七肽重復(fù)序列 HR1 和 HR2，HR1 和 HR2 能夠通過(guò)相互作用使 S2 發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，形成與細(xì)胞膜類(lèi)似的六聚體結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜融合。因此，根據(jù)這兩個(gè)七肽重復(fù)序列可以設(shè)計(jì)抗病毒肽，通過(guò)抑制 HR1 和 HR2 介導(dǎo)的刺突蛋白結(jié)構(gòu)變化，阻斷膜融合。Liu 等[26]分別針對(duì) HR1 和 HR2 的氨基酸序列設(shè)計(jì)了不同長(zhǎng)度的肽段，通過(guò)測(cè)定這些肽段對(duì) SARS 病毒復(fù)制的影響以及分子結(jié)合實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)由 HR2 的 1153-1189 殘基衍生的抗病毒肽先導(dǎo)物 CP-1（IC50= 19 μmol/L）。在 MERS 病毒出現(xiàn)后，該研究組解析了 MERS 病毒刺突蛋白 S2 亞單位的蛋白結(jié)晶結(jié)構(gòu)，并在此基礎(chǔ)上基于上述類(lèi)似的原理，構(gòu)建了多個(gè)能夠覆蓋 HR1 和HR2 結(jié)合區(qū)域的新肽段，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè) HR2 衍生肽段 HR2P 能夠有效抑制 MERS 病毒的復(fù)制（IC50= 0.6 μmol/L）以及刺突蛋白介導(dǎo)的膜融合（IC50= 0.8 μmol/L），同時(shí)發(fā)現(xiàn)在 HR2P 的結(jié)構(gòu)中引入親水氨基酸能夠改善溶解性、穩(wěn)定性和抗病毒活性[27]。

圖 1 冠狀病毒進(jìn)入抑制劑

2.1.4 II 型跨膜絲氨酸蛋白酶 TMPRRS2 介導(dǎo)的融合抑制劑 TMPRRS2 是一種在呼吸道表皮細(xì)胞表達(dá)的宿主細(xì)胞跨膜絲氨酸蛋白酶，具有活化病毒表面糖蛋白，促進(jìn)病毒以非內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞的作用。已有研究顯示，TMPRRS2 能夠活化 SARS、MERS 和 NL63 病毒通過(guò)非內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞的膜融合過(guò)程[28-29]。而且，冠狀病毒 229E 臨床分離株可能更多依賴(lài) TMPRRS2 介導(dǎo)的融合方式進(jìn)入人呼吸道表皮細(xì)胞[30-31]。因此，TMPRRS2 抑制劑具有抗冠狀病毒藥物的研究潛力。甲磺酸卡莫司他是一個(gè)用于治療胰腺炎的小分子絲氨酸蛋白酶抑制劑上市藥物?？舅╟amostat，3，圖 1）不僅在表達(dá) ACE2 和 TMPRSS2 酶的細(xì)胞模型上阻止了 SARS 病毒和 NL63 病毒與細(xì)胞膜的融合，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，卡莫司他可有效保護(hù)小鼠受 SARS-CoV 感染所致的死亡，存活率為 60%[32-33]。Yamamoto 等[34]通過(guò)建立特定的 MERS-細(xì)胞融合模型篩選 1000 多個(gè) FDA 上市藥物后，發(fā)現(xiàn)并確證絲氨酸蛋白酶抑制劑萘莫司他（nafamostat，4，圖 1）具有依賴(lài) TMPRRS2 酶活性，阻止 MERS 病毒膜融合的作用，IC50為 0.1 μmol/L。而且，在病毒感染體外模型上，萘莫司他在 1 nmol/L 濃度下顯示出明顯的抗 MERS-CoV 復(fù)制的活性，活性強(qiáng)度是化合物卡莫司他的 100 倍。近日，最新藥物篩選研究證實(shí)萘莫司他對(duì)SARS-CoV-2 病毒也具有一定的抑制活性（EC50= 22.50 μmol/L，CC50> 100 μmol/L，SI > 4.44）[35]。

2.1.5 組織蛋白酶抑制劑 針對(duì) SARS-CoV 的蛋白酶抑制劑研究顯示，組織蛋白酶L 抑制劑 MDL28170（5，圖 1）抑制了 S 蛋白介導(dǎo)的病毒感染，同時(shí)認(rèn)為相比組織蛋白酶 B，組織蛋白酶 L的蛋白水解作用對(duì)于病毒進(jìn)入和感染可能更重要。Zhou 等[33]在高通量藥物再評(píng)價(jià)篩選中發(fā)現(xiàn)小分子組織蛋白酶B 和 L雙重抑制劑 K11777（6，圖 1）能夠抑制多種冠狀病毒（SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-NL63）進(jìn)入細(xì)胞，體外 IC50在納摩爾濃度水平。同時(shí)，該研究報(bào)道顯示，聯(lián)合組織蛋白酶抑制劑K11777 和蛋白酶抑制劑卡莫司他能夠明顯增強(qiáng)體外抗病毒作用，但遺憾的是，在 SARS-CoV 感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中K11777 衍生物單用或與卡莫司他聯(lián)合均沒(méi)有得到陽(yáng)性結(jié)果。Elshabrawy 等[36]通過(guò)高通量篩選發(fā)現(xiàn)小分子廣譜抗病毒化合物5705213（7，圖 1）及其衍生物能特異性地抑制組織蛋白酶 L 水解蛋白的作用，抑制 SARS-CoV 假病毒進(jìn)入細(xì)胞。并且，7與 TMPRSS2 抑制劑聯(lián)用具有協(xié)同作用。

2.1.6 其他病毒進(jìn)入抑制劑 Adedeji 等[37]曾通過(guò)帶有 SARS 病毒表面糖蛋白的假病毒模型，對(duì)化合物庫(kù)進(jìn)行篩選得到三個(gè) SARS 病毒進(jìn)入抑制劑（SSAA09E1、SSAA09E2 和 SSAA09E3，圖 1），并且發(fā)現(xiàn)這三個(gè)化合物擁有三種不同的作用機(jī)制。SSAA09E1（8）通過(guò)抑制組織蛋白酶 L 的活性阻止病毒 S 蛋白水解；SSAA09E2（9）抑制了病毒與細(xì)胞受體 ACE2 的相互作用；SSAA09E3（10）則抑制了病毒的膜融合。Apayd?n 等[38]合成了一系列以 1-硫雜-4-氮雜螺[4.5]癸-3-酮為骨架的流感病毒融合抑制劑化合物，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這類(lèi)化合物還具有抗冠狀病毒的活性，化合物11（圖 1）體外抗 HCoV-229E 病毒的 EC50為 5.5 μmol/L。Lundin 等[39]在篩選抗 HCoV-229E 病毒化合物時(shí)，從一萬(wàn)多化合物中發(fā)現(xiàn)化合物 K22（12，圖 1）能夠有效抑制病毒復(fù)制，體外 EC50為 0.7 μmol/L，并且發(fā)現(xiàn)K22 在病毒進(jìn)入階段的后期顯示出最強(qiáng)的抗病毒活性。機(jī)制研究顯示，K22 通過(guò)抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞后雙層膜囊泡的形成，而阻斷了病毒 RNA 合成。雖然K22 耐藥變異出現(xiàn)在 nsp6 蛋白殘基，但是其作用靶點(diǎn)是否就是 nsp6 還不清楚；另外，K22 在體外還顯示出廣譜抗冠狀病毒活性，對(duì) SARS-CoV 和 MERS-CoV 均具有抑制活性。Yi 等[40]通過(guò)篩選中草藥提取物庫(kù)，發(fā)現(xiàn)小分子葡萄糖四沒(méi)食子酸酯TGG（Tetra--β-D-glucose，13，圖 1）和木犀草素（luteolin，14，圖 1）能夠阻止帶有 SARS 表面刺突糖蛋白的假病毒進(jìn)入細(xì)胞，并在野生病毒感染細(xì)胞模型上證實(shí)了這兩個(gè)化合物的抗病毒活性（EC50值分別為 4.5 和 10.6 μmol/L）。

2.2 病毒復(fù)制抑制劑

2.2.1 病毒蛋白酶 3CLpro抑制劑 3C樣蛋白酶（3-chymotrypsin-like protease，3CLpro）是位于冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白 nsp5 上的半胱氨酸蛋白酶，負(fù)責(zé)催化冠狀病毒前體多蛋白水解為病毒功能蛋白。3CLpro單體無(wú)活性，二聚體具有催化活性。其酶活性結(jié)構(gòu)中含有 Cys-His 二元催化單元，His 幫助 Cys 脫去氫質(zhì)子產(chǎn)生親核性的半胱氨酸，開(kāi)始對(duì)目標(biāo)蛋白水解加工。SARS 病毒 3CLpro與六肽基氯甲基酮（Cbz-Val-Asn-Ser-Thr-Leu-Gln-CMK，15，圖 2）復(fù)合物的 X 射線晶體結(jié)構(gòu)顯示：3CLpro單體含有三個(gè)結(jié)構(gòu)域（I、II 和 III），抑制劑的結(jié)合區(qū)域位于 I 和 II 之間的狹縫處，3CLpro的底物結(jié)合亞單位 S1 對(duì)底物 P1 區(qū)的谷氨酰胺有特異性的要求[41]。3CLpro作為冠狀病毒主要蛋白酶具有較高保守性，因此成為廣譜抗病毒藥物的重要靶點(diǎn)[42]。Pillaiyar 等[43]在 2016 年曾對(duì) SARS 病毒 3CL 蛋白酶抑制劑做了非常系統(tǒng)的綜述，詳細(xì)闡述了近 200 個(gè)肽類(lèi)似物或小分子抑制劑的研究結(jié)果。因此，本文將不再贅述，僅在其基礎(chǔ)上對(duì)近幾年的新進(jìn)展進(jìn)行闡述。

首先，蛋白酶抑制劑 GC376（16，圖 2）已經(jīng)被證明可以用于貓的冠狀病毒感染治療，Galasiti Kankanamalage等[44]從 GC376 與 MERS-CoV 的 3CLpro蛋白復(fù)合物結(jié)晶出發(fā)，基于增加化合物與 S3 位點(diǎn)作用力和改善化合物溶解性質(zhì)的目的，設(shè)計(jì)合成了 P4 位置含有取代哌啶基團(tuán)的一系列新型肽模擬物，在生化和細(xì)胞水平上證實(shí)了這類(lèi)化合物對(duì) MERS-CoV 蛋白酶的抑制活性以及抗 MERS-CoV 活性，同時(shí)用 X 射線衍射證明了活性化合物17（圖 2）靶向 3CLpro的作用機(jī)制。AG7088（18，圖 2）是已知的小 RNA 病毒3C蛋白酶抑制劑，但是對(duì) MERS-CoV 沒(méi)有抑制活性。Kumar 等[45]通過(guò)化學(xué)改造得到了一類(lèi)帶醛基彈頭的肽類(lèi)似物。在篩選抗 MERS-CoV 化合物的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)這類(lèi)化合物的抗病毒潛力，其中有三個(gè)類(lèi)似物（19，圖 2）對(duì) MERS-CoV、HCoV-229E 和 OC43 均有抗病毒活性，EC50在微摩爾濃度，而且對(duì) MERS-CoV 的活性最強(qiáng)。以六肽 CMK 衍生物為起點(diǎn)的肽或擬肽類(lèi) 3CLpro抑制劑結(jié)構(gòu)優(yōu)化一直在進(jìn)行，研究進(jìn)展主要體現(xiàn)在彈頭連接和共價(jià)失活的優(yōu)化策略變化上。最近，Zhang 等[46]在前期研究基礎(chǔ)上通過(guò)在 P1 位置引入 α-酮酰胺（圖2），設(shè)計(jì)合成了一類(lèi)新型的肽模擬物，并在復(fù)制子細(xì)胞模型上證實(shí)多個(gè)化合物（20，圖 2）對(duì) α 和 β 兩個(gè)種屬的冠狀病毒（HCoV-NL63、MERS-CoV、SARS-CoV）均顯示明顯抑制活性，體外 IC50在低微摩爾水平；更值得一提的是，在 MERS 病毒感染的 Huh7 細(xì)胞模型上，這類(lèi)化合物的抗病毒活性達(dá)到了低納摩爾水平。盡管有較多的前期研究，可能是因?yàn)殡念?lèi)化合物成藥性低的原因，至今還沒(méi)有進(jìn)入臨床試驗(yàn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也比較少見(jiàn)報(bào)道，多數(shù)還僅限于生化或細(xì)胞水平的結(jié)果。

日本 Akaji 研究組一直在進(jìn)行 R188I 突變 SARS 病毒 3CLpro抑制劑研究，為了降低肽鏈酶解和共價(jià)結(jié)合毒性問(wèn)題，他們以前期研究的肽類(lèi)抑制劑21（圖 3）為起點(diǎn)，致力于設(shè)計(jì)新型骨架來(lái)替換肽鏈和更安全的彈頭基團(tuán)替代醛基[47-48]。通過(guò)在 P2 區(qū)擴(kuò)展引入大體積疏水性骨架先后設(shè)計(jì)合成了新型含有氫化異喹啉骨架（22，圖 3）和八氫異色烯骨架（23，圖 3）的擬肽類(lèi)酶抑制劑；在氫化異喹啉骨架類(lèi)化合物的研究中，分別在提高溶解性和安全性方面取得了相應(yīng)的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了親水性增強(qiáng)的衍生物24（圖 3）和更安全的新型硫縮醛彈頭衍生物25（圖 3）。但上述工作只考察了化合物對(duì)酶的抑制活性，沒(méi)有抗病毒活性的數(shù)據(jù)，目前的酶活性數(shù)據(jù)還有待改善。另外，他們采用骨架躍遷還設(shè)計(jì)了基于絲氨酸骨架的新擬肽化合物 SK23（26，圖 3）以及苯基異絲氨酸化合物 SK80（27，圖 3），為后期的小分子 3CLpro抑制劑發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)[49-50]。苯并三唑已經(jīng)被證實(shí)是小分子 3CLpro抑制劑的活性骨架。Karypidou 等[51]通過(guò)對(duì)合成的庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn)了一個(gè)對(duì) HCoV-E229 具有微摩爾級(jí)抑制活性的稠環(huán)三唑類(lèi)新結(jié)構(gòu)化合物（28，圖 3），體外 EC50在 10 μmol/L 左右。他們通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬和對(duì)接分析確定活性化合物的靶點(diǎn)可能是 3CLpro。此外，黃酮類(lèi)化合物草棉黃素（29，圖 3）和漆葉苷（30，圖 3）也曾被證實(shí)對(duì) SARS 和 MERS-3CLpro具有抑制活性，從而發(fā)揮抗病毒復(fù)制的作用[52-53]。

圖2 擬肽類(lèi)3CLpro抑制劑的發(fā)現(xiàn)和主要結(jié)構(gòu)類(lèi)型

圖 3 抗耐藥冠狀病毒3CLpro蛋白酶抑制劑及小分子3CLpro抑制劑

2.2.2 木瓜樣蛋白酶抑制劑 冠狀病毒木瓜樣蛋白酶（papain-like protein，PLpro）位于 nsp3 上的半胱氨酸蛋白酶，具有去泛素化功能[54]。一般冠狀病毒編碼兩個(gè)木瓜樣蛋白酶 PLP1 和 PLP2，但是 SARS 和 MERS 病毒編碼一個(gè)木瓜樣蛋白 PLpro?，F(xiàn)在 PL 蛋白酶抑制劑的研究大都是針對(duì) SARS-CoV 和 MERS-CoV 的 PLpro進(jìn)行的，SARS 病毒 PLpro的活性位點(diǎn)含有一個(gè)與 3CLpro二元催化單元類(lèi)似的 Cys112-His273-Asp287 三元催化單位，其中的 Asp287 的功能是協(xié)助 His273 催化 Cys112 脫氫，酶催化原理與 3CLpro類(lèi)似，均是 Cys 由 His 協(xié)助催化脫氫后通過(guò)親核進(jìn)攻實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)底物水解切割[55]。在 SARS 病毒的 PL 蛋白結(jié)晶結(jié)構(gòu)被解析之前，尋找 PLpro蛋白酶抑制劑的主要途徑是高通量篩選。2011 年，F(xiàn)rieman 等[56]首先建立了一個(gè) PLP 酶活性誘導(dǎo)的慢生長(zhǎng)酵母篩選體系，并對(duì) NIH 化合物庫(kù)中的 2000 個(gè)結(jié)構(gòu)多樣化合物進(jìn)行了篩選。雖然化合物NSC158362（31，圖 4）和 NSC158011（32，圖 4）被證實(shí)能逆轉(zhuǎn) PLP 酶誘導(dǎo)的慢生長(zhǎng)，而且31在細(xì)胞水平對(duì)SARS-CoV 也具有明顯的抑制活性，但對(duì) PLP 酶活性卻沒(méi)有直接抑制作用；而32沒(méi)有抑制病毒生長(zhǎng)的作用，但存在對(duì)PLP 酶活性的抑制。Ratia 等[57-58]先建立了一個(gè)高靈敏度帶有熒光報(bào)告基團(tuán)的 PLpro抑制劑篩選模型，通過(guò)對(duì) 50 080 個(gè)化合物篩選發(fā)現(xiàn)化合物 7724772（33，圖 4）和 6577871（34，圖 4）能劑量依賴(lài)地抑制 PLpro活性，IC50為 20 和 59 μmol/L，以這兩個(gè)化合物為起點(diǎn)，先后結(jié)構(gòu)優(yōu)化衍生出兩個(gè)選擇性 PLpro非共價(jià)抑制劑GRL0617（35，IC50= 0.6 ± 0.1 μmol/L，圖 4）和36（IC50=0.32 ± 0.01 μmol/L，圖 4），同時(shí)證實(shí)35和36具有抗SARS-CoV 復(fù)制活性，EC50分別為（14.5 ± 0.8）和（9.1±0.5）μmol/L。該研究還獲得了多個(gè)活性化合物與 PLpro復(fù)合物結(jié)晶，為后期結(jié)構(gòu)優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)[59]。雙硫侖（disulfilam，37，圖 4）是一種硫醇反應(yīng)性化合物，可以共價(jià)修飾半胱氨酸殘基。Lin 等[60]通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出，雙硫侖對(duì) SARS 和 MERS 的 PLpro酶均表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性抑制作用，但作用機(jī)制不同，它是 SARS-PLpro的共價(jià)不可逆抑制劑，同時(shí)是 MERS-PLpro的變構(gòu)調(diào)節(jié)抑制劑。IC50分別是（24.1 ± 1.8）、（14.6 ± 1.3）μmol/L。巰嘌呤類(lèi)腫瘤治療藥物 6-巰基嘌呤（6-MP，38，圖 4）和 6-硫鳥(niǎo)嘌呤（6-TG，39，圖 4）也曾被發(fā)現(xiàn)是 SARS-PLpro的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，同時(shí)具有抗 SARS-CoV 活性，IC50分別為（26.9 ± 7.5）和（24.4 ± 4.3）μmol/L[61]。后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)這兩個(gè)化合物也是 MERS-PLpro抑制劑，它們與免疫抑制劑霉酚酸聯(lián)合還具有協(xié)同的抗 MER-CoV 活性[62]。但是，可以預(yù)測(cè)這類(lèi)抗腫瘤化合物的毒性問(wèn)題最終會(huì)限制它們的抗病毒應(yīng)用前景。

圖 4 冠狀病毒PLpro蛋白酶抑制劑

Lee 等[63]通過(guò)測(cè)定 MERS-PLpro蛋白結(jié)晶發(fā)現(xiàn)其與 SARS-PLpro蛋白結(jié)構(gòu)大致相同，也具有去泛素化活性，但是在抑制劑結(jié)合位點(diǎn)存在明顯不同。得出這兩個(gè)病毒的 PLpro酶抑制劑可能不具有交叉效應(yīng)的結(jié)論，并在對(duì) 25 000 個(gè)化合物同時(shí)進(jìn)行 SARS-PLpro和 MERS-PLpro抑制活性篩選后，證實(shí)了這個(gè)推測(cè)。而且，篩選還發(fā)現(xiàn)了具有不同作用機(jī)制的雙重酶抑制劑小分子片段。從而再次證明 MERS 病毒的 PLpro酶與 SARS 病毒的 PLpro酶對(duì)抑制劑具有不同的識(shí)別模式。采用類(lèi)似的方法，該研究小組又對(duì) 30 000 個(gè)商業(yè)化合物開(kāi)展了 MERS-PLpro抑制劑的定向篩選，并對(duì)得到的陽(yáng)性化合物進(jìn)行多輪活性和機(jī)制的驗(yàn)證，確定了先導(dǎo)化合物40（圖 4）。目前他們計(jì)劃將這兩部分工作結(jié)合起來(lái)以發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)的 MERS-PLpro抑制劑[64]。

另外，多個(gè)具有廣泛的生物活性的天然產(chǎn)物被研究證實(shí)具有 PLpro抑制活性，如多酚類(lèi)（41，圖 4）[65]、黃酮天竺葵酯（42，圖 4）[66]、丹參酮（43，圖 4）[67]、肉桂酰胺（44，圖 4）[68]、查爾酮（45，圖 4）[69]、姜黃素類(lèi)化合物（46，圖 4）[70]。上述天然產(chǎn)物的研究結(jié)果多數(shù)是基于生化水平分析方法的酶抑制活性，缺少對(duì)于細(xì)胞水平病毒復(fù)制的影響數(shù)據(jù)，用于抗病毒藥物研究的潛力有待開(kāi)發(fā)。

2.2.3 依賴(lài) RNA 的 RNA 聚合酶（RdRp）抑制劑 RdRp 位于非結(jié)構(gòu)蛋白 nsp12 內(nèi)，是 RNA 病毒基因復(fù)制的關(guān)鍵酶。因?yàn)槭遣《咎禺愋缘鞍?，所以作為抗病毒藥物的重要靶點(diǎn)，具有副作用小的優(yōu)勢(shì)[71]。Remdesivir（RDV，GS-5734，47，圖 5）是一個(gè)腺苷單磷酸酯前藥，在體內(nèi)能快速生成活性三磷酸形式摻入病毒 RNA 合成，抑制 RdRp 活性，終止病毒復(fù)制，發(fā)揮抗 RNA 病毒作用[72]。目前已經(jīng)完成治療埃博拉病毒感染的 II 期臨床研究。除了埃博拉病毒，RDV在體外對(duì) MHV、MERS-CoV 和 SARS-CoV 等復(fù)制均顯示出顯著抑制活性，EC50分別為 0.03、0.074 和0.069 μmol/L，在恒河猴動(dòng)物模型上對(duì) MERS 病毒感染顯示出預(yù)防和治療的雙重效果[73-74]。而且，RDV 對(duì)病毒 RdRp 和核酸外切酶均有抑制活性，具有耐藥屏障高的優(yōu)勢(shì)[75]。我國(guó)的篩選研究也證實(shí)，RDV 對(duì)新型冠狀病毒SARS-CoV-2 復(fù)制有抑制活性，在 SARS-CoV-2 感染的 VeroE6 細(xì)胞體系中 EC90值為 1.76 μmol/L[35]。目前，RDV 正在武漢開(kāi)展治療新冠肺炎的 III 期臨床，預(yù)計(jì)不久會(huì)有結(jié)果公布。Galidesivir（BCX4430，48，圖 5）也是一種腺嘌呤核苷類(lèi)似物，Warren 等[76]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其能通過(guò)誘導(dǎo) RNA 鏈終止來(lái)抑制病毒 RNA 聚合酶的功能，并評(píng)估了 galidesivir 對(duì)多種 RNA 病毒的抑制活性，其中抑制 MERS-CoV 的 EC50為 68.4 μmol/L，抑制 SARS-CoV 的 EC50為 57.7 μmol/L。通過(guò)靶向RdRp 和 S-腺苷-I-同型半胱氨酸水解酶（SAH）的雙重抑制劑設(shè)計(jì)，一系列 6'-氟代芒霉素類(lèi)似物也被合成并證實(shí)了抗冠狀病毒的活性。其中，代表化合物49（圖 5）表現(xiàn)出廣譜的抗病毒活性，其抗 SARS-CoV 和 MERS-CoV活性的 EC50分別為 0.5 和 0.2 μmol/L[77]。

圖 5 冠狀病毒復(fù)制抑制劑

2.2.4 解旋酶抑制劑 解旋酶是一種利用 ATP 水解產(chǎn)生的能量催化分離雙核苷鏈的機(jī)動(dòng)蛋白，冠狀病毒也編碼解旋酶，位于基因組 nsp13 位置，在病毒 mRNA 轉(zhuǎn)錄和翻譯等多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮作用[78]。SSYA10-001（50，圖 5）是一個(gè)解旋酶非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，通過(guò)特異性阻斷冠狀病毒 nsp13 蛋白對(duì)雙鏈 RNA 和雙鏈 DNA 的解鏈活性（IC50分別為 5.70 和 5.30 μmol/L），發(fā)揮抗多種冠狀病毒（SARS-CoV、MHV 和 MERS-CoV）的活性，SSYA10-001 體外抑制 SARS-CoV 和 MERS-CoV 復(fù)制的 EC50分別為 7 和25 μmol/L[79-80]。在此基礎(chǔ)上，Zaher 等[81]利用基于解旋酶活性的熒光共振能量轉(zhuǎn)移模型，合成并考察了一系列三唑類(lèi)衍生物對(duì) MERS-CoV 解旋酶的抑制活性，化合物51（圖 5）對(duì) MERS-CoV 解旋酶抑制活性最強(qiáng)，IC50為2.5 μmol/L，同時(shí)文獻(xiàn)采用虛擬對(duì)接進(jìn)行了靶點(diǎn)驗(yàn)證，但未進(jìn)行細(xì)胞水平抗病毒活性的考察。

2.2.5 其他病毒復(fù)制抑制劑 洛匹那韋（lopinavir，LPV，52，圖 5）和利托那韋（ritonavir，RTV，53，圖 5）都是 HIV 病毒蛋白酶抑制劑，二者的復(fù)方片（克力芝）通過(guò) RTV 抑制細(xì)胞色素 P450 代謝活性，實(shí)現(xiàn)了增強(qiáng)藥效的目的?？肆χタ?CoV 的潛力源于對(duì)抗病毒藥物的經(jīng)驗(yàn)篩選和醫(yī)院內(nèi)服藥艾滋病人抵抗 SARS 病毒的臨床發(fā)現(xiàn)[82-84]。在 MERS 疫情出現(xiàn)時(shí)，LPV-RTV 組合也顯示出治療潛力，被應(yīng)用于臨床研究。而我國(guó)針對(duì) SARS-CoV-2 感染引發(fā)的新冠肺炎應(yīng)急治療也納入了該藥物組合，多項(xiàng)克力芝聯(lián)合干擾素、利巴韋林或其他抗病毒藥物的治療方案正在進(jìn)行臨床研究。盡管有研究將這兩個(gè)抗 HIV 藥物與 SARS-CoV 的 3CLpro進(jìn)行了結(jié)合動(dòng)力學(xué)模擬和對(duì)接分析，表明它們能夠與 3CLpro的活性位點(diǎn)發(fā)生相互作用，但確切的抗冠狀病毒機(jī)制至今未明[85-86]。

利巴韋林（ribavirin，RBV，54，圖 5）是致突變核苷類(lèi)似物，能夠作為非天然核苷摻入 RNA 合成，導(dǎo)致基因突變，從而起到降低病毒毒力和抑制病毒復(fù)制的作用。RBV 已經(jīng)被證實(shí)具有廣譜抗病毒活性，臨床上用于呼吸合胞病毒和 HCV 病毒感染治療。雖然 RBV 在 SARS 和 MERS 疫情暴發(fā)期間都曾與干擾素聯(lián)合用于抗病毒治療，但其臨床療效并不顯著[87]。原因可能有兩個(gè)：第一，RBV 的體外抗冠狀病毒活性并不強(qiáng)，因此正常給藥劑量下的血藥濃度不能達(dá)到其抗病毒藥效濃度，導(dǎo)致臨床效果不佳[87-90]；第二，冠狀病毒含有校對(duì)功能的核酸外切酶，能夠糾正 RBV 摻入 RNA 引起的致突變效應(yīng)，導(dǎo)致其效力降低[91-92]。另外一個(gè)致突變核苷類(lèi)似物β-d-4-羥基胞苷（NHC，55，圖 5）在十幾年前被 Barnard 等通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)，其在 6 μmol/L 給藥濃度下對(duì)一株 SARS 病毒生成的抑制率達(dá)到 90%，但后期在 SARS 病毒感染小鼠模型上沒(méi)有得到活性驗(yàn)證[93-94]。最近，另外一個(gè)獨(dú)立的研究組發(fā)現(xiàn)NHC 具有抗鼠肝炎冠狀病毒（MHV）和 MERS-CoV 的活性，體外抗病毒的EC50分別為 0.17 ?和 0.56 μmol/L，而且發(fā)現(xiàn)病毒核酸外切酶對(duì) NHC 的抗病毒強(qiáng)度影響不大，此外，NHC 具有耐藥屏障高的優(yōu)勢(shì)[95]。

2.3 基于宿主細(xì)胞因子的抗病毒藥物

病毒的整個(gè)生命周期都離不開(kāi)宿主細(xì)胞因子的參與，而且，特定的宿主因子能對(duì)生物學(xué)特征類(lèi)似的病毒產(chǎn)生相同的影響，因此，宿主靶向抗病毒藥物也通常被證實(shí)具有廣譜抗病毒活性。干擾素（IFNs）是宿主靶向抗病毒藥物的典型代表，IFN 是宿主細(xì)胞受到病毒感染后產(chǎn)生的能夠抑制病毒的抵抗蛋白質(zhì)，主要功能是抑制病毒的轉(zhuǎn)錄及 mRNA 的合成、翻譯，阻止病毒蛋白合成并影響病毒的成熟和釋放。因此，重組 IFNs 的使用能夠增強(qiáng)宿主免疫反應(yīng)，在多種病毒感染，特別是沒(méi)有治療藥物的突發(fā)或未知病毒的治療過(guò)程中起到重要作用。在 SARS 和 MERS 疫情期間，IFNs 被用于臨床治療，但是臨床受益存在爭(zhēng)議[87, 96]。有研究者考察了不同亞型干擾素的體外抗 MERS 病毒活性，結(jié)果顯示，不同亞型的干擾素對(duì) MERS 病毒敏感性存在顯著差異，IFN-β（IC50= 1.37 U/ml）的體外抗 MERS 病毒活性最強(qiáng)，分別是其他亞型干擾素的數(shù)十甚至上百倍[97]。因此，采用 IFN-β 進(jìn)行臨床治療可能更有利[98]。

硝唑尼特（nitazoxanide，NTZ，56，圖 6）是一個(gè)治療寄生蟲(chóng)感染的特效藥物，也是具有廣譜抗病毒活性的多功能分子[99]。作用機(jī)制研究顯示，NTZ 及其代謝產(chǎn)物能夠增強(qiáng)宿主抗病毒反應(yīng)，提高干擾素刺激因子的表達(dá)[100-101]。最近我國(guó)的科學(xué)家發(fā)現(xiàn) NTZ 對(duì)新冠病毒 SARS-CoV-2 也具有一定的抑制活性，體外 EC50為 2.12 μmol/L。

多個(gè)研究結(jié)果顯示，次黃嘌呤核苷-5'-單磷酸脫氫酶（IMPDH）抑制劑霉酚酸（mycophenolic acid，MPA，57，圖 6）是一個(gè)廣譜抗病毒化合物，除了抑制多種病毒復(fù)制的活性外，MPA 還能誘導(dǎo)干擾素刺激因子的表達(dá)，增敏病毒對(duì)干擾素的反應(yīng)性[102]。研究分別證實(shí)，MPA 對(duì) MERS 病毒的復(fù)制有抑制活性，體外 EC50在微摩爾水平，并顯示出與 INF-β 的協(xié)同增效作用[90, 97]。然而，免疫抑制活性以及致畸毒性問(wèn)題對(duì)于體外抗病毒活性并不強(qiáng)的 MPA 來(lái)說(shuō)是作為抗病毒藥物應(yīng)用的極大障礙。

親環(huán)蛋白（cyclophilins，Cyps）是一類(lèi)肽-脯氨酰異構(gòu)酶，人體表達(dá) 7 種主要的親環(huán)蛋白（CypA、CypB、CypC、CypD、CypE、Cyp40 和 CypNK），其中 CypA 參與多種病毒復(fù)制，是病毒復(fù)制伴侶蛋白。CypA 抑制劑環(huán)孢素 A（cyclosporin A，58，圖 6）能夠抑制多種冠狀病毒，如 SARS-CoV、HCoV-229E 和 NL-63 的復(fù)制，體外 EC50分別為 3.3、2.3 和 2.3 μmol/L。同時(shí)它在SARS 病毒的復(fù)制子模型上也表現(xiàn)出劑量依賴(lài)的抗病毒作用，說(shuō)明環(huán)孢素 A 作用于病毒基因組復(fù)制階段[103]。Ma-Lauer 等[104]則進(jìn)一步證實(shí)環(huán)孢素 A 通過(guò)阻止 CypA 與病毒核衣殼蛋白的相互作用，抑制病毒核衣殼脫衣和基因組復(fù)制。

抗瘧藥氯喹（chloroquine，59，圖 6）曾多次被研究者在高通量篩選中發(fā)現(xiàn)具有抗冠狀病毒的活性，對(duì)不同病毒類(lèi)型的體外 EC50都在微摩爾級(jí)[84, 105-107]。氯喹通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi) pH 值而抑制了細(xì)胞內(nèi)吞作用，從而起到降低病毒進(jìn)入的作用[108]。還有研究顯示，氯喹的抗冠狀病毒 229E 活性可能與抑制細(xì)胞 p38-MAPK 激酶活化有關(guān)[107]。但遺憾的是，氯喹在 SARS 病毒感染的動(dòng)物模型上并沒(méi)有顯示出活性[94]。在針對(duì) 2019 新冠病毒的藥物篩選中，氯喹也被證實(shí)具有體外抑制病毒復(fù)制的活性[35]，Yao 等[109]通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了氯喹和羥氯喹抗 SARS-CoV-2 的活性，體外 EC50分別為 5.47 和 0.72 μmol/L。目前，我國(guó)正在開(kāi)展氯喹用于新冠肺炎治療的臨床研究（ChiCTR2000029609）。

2.4 蛋白激酶抑制劑

蛋白激酶是細(xì)胞信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因子，在病毒-宿主發(fā)生相互作用的過(guò)程中，多種蛋白激酶被證實(shí)參與病毒復(fù)制。2014 年，Sisk 等[110-111]在尋找抗 MERS 病毒藥物時(shí)，通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn) Abelson（Abl）激酶抑制劑伊馬替尼（imatinib，60，圖 6）和達(dá)沙替尼（dasatinib，61，圖 6）對(duì) SARS 和 MERS 病毒復(fù)制具有微摩爾級(jí)抑制活性。后期的研究表明伊馬替尼能夠抑制病毒進(jìn)入階段的膜融合環(huán)節(jié)從而抑制病毒生成，并且證實(shí)其作用靶點(diǎn) Abelson 酪氨酸蛋白激酶2（Abl2）是 MERS 和 SARS 病毒復(fù)制的輔助因子。Src 家族酪氨酸激酶抑制劑塞卡替尼（saracatinib，62，圖 6）對(duì)MERS 病毒復(fù)制也顯示出抑制活性，并且同樣是在病毒復(fù)制的早期發(fā)揮作用[112]。

圖 6 宿主靶向抗冠狀病毒活性化合物

2.5 具有抗病毒活性的神經(jīng)受體調(diào)節(jié)劑

在針對(duì)上市藥物再評(píng)價(jià)的高通量篩選研究中，多個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)抑制劑被發(fā)現(xiàn)具有抗 SARS 或 MERS 病毒活性。在de Wilde 等[84]的研究中，多種神經(jīng)遞質(zhì)抑制劑，如氯丙嗪（chlorpromazine，63，圖 6）、氟奮乃靜（fluphenazine，64，圖 6）、異丙嗪（promethazine，65，圖 6）、三氟丙嗪（triflupromazine，66，圖 6）、阿司咪唑（astemizole，67，圖 6）和氯丙咪嗪（clomipramine，68，圖 6）等，在微摩爾水平抑制了 MERS 病毒復(fù)制和 MERS 假病毒的內(nèi)吞，同時(shí)，氯丙嗪、氟奮乃靜和異丙嗪還顯示出抑制細(xì)胞膜融合的作用[113]。氯丙嗪和阿片受體激動(dòng)劑洛哌丁胺（loperamide，69，圖 6）還被證實(shí)對(duì) SARS、MERS 和 229E 三種冠狀病毒均具有抗病毒活性。

2.6 傳統(tǒng)中藥治療 SARS-CoV-2 感染的效果

SARS-CoV-2 引起的新冠肺炎具有中醫(yī)寒疫病特征，因此，傳統(tǒng)中藥治療也被我國(guó)納入《新型冠狀病毒肺炎診療方案》，并分別針對(duì)醫(yī)學(xué)觀察期人群和確診病例制定了不同的給藥方案。醫(yī)學(xué)觀察期人群推薦使用藿香正氣膠囊和連花清瘟顆粒等清熱解毒中成藥進(jìn)行預(yù)防干預(yù)，而確診病例則根據(jù)癥狀分型給予不同處方的清肺排毒湯方劑治療。連花清瘟顆粒由連翹、金銀花、麻黃（炙）等 13 味中藥組成，能夠有效緩解病毒性呼吸系統(tǒng)疾病，對(duì) SARS 和 MERS 冠狀病毒也具有明顯的抑制和殺傷作用。最新研究表明，連花清瘟顆粒能夠明顯改善 SARS-CoV-2 感染患者的發(fā)熱、咳嗽、乏力、氣短等臨床癥狀，降低輕癥患者向重癥轉(zhuǎn)移比例[114-115]。“清肺排毒湯”出自張仲景所著的《傷寒雜病論》，主要由麻杏石甘湯、射干麻黃湯、小柴胡湯、五苓散組成，此外融合了大青龍湯、橘枳姜湯和茯苓杏仁甘草湯等方意[116]。王饒瓊等[117]通過(guò)分析清肺排毒湯治療98 例新型冠狀病毒肺炎患者的臨床療效得出，清肺排毒湯能顯著改善患者的異常生化指標(biāo)和臨床癥狀，而且患者不良反應(yīng)發(fā)生率低，其治療 9 d 后的總有效率為 92.09%。

由于中藥成分復(fù)雜，作用機(jī)制不能像單體化學(xué)藥那樣得到清楚的闡述，因此我國(guó)傳統(tǒng)中藥一直受到國(guó)外研究者的質(zhì)疑，特別是在臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和結(jié)果判定上難以得到國(guó)際認(rèn)可。但在本次疫情中，傳統(tǒng)中藥對(duì)于 COVID-19 的治療起到了非常積極的作用。相信隨著中西醫(yī)結(jié)合和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展，無(wú)論是中藥有效單體分離還是傳統(tǒng)方劑的科學(xué)推廣都將得到更多研究者的關(guān)注，我國(guó)中醫(yī)藥也將會(huì)在人類(lèi)健康領(lǐng)域得到更多突破性的成果。

3 總結(jié)

在近 20 年間，冠狀病毒新變種不斷出現(xiàn)，致病力變強(qiáng)的同時(shí)呈現(xiàn)出從局地暴發(fā)向全球擴(kuò)散的特點(diǎn)，給全球健康帶來(lái)極大威脅。在沒(méi)有疫苗可用的情況下，抗病毒藥物研究對(duì)于病毒防控至關(guān)重要。令人遺憾的是，目前還沒(méi)有治療冠狀病毒感染的特效藥物被批準(zhǔn)上市。通過(guò)對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)的整理分析可以看出，針對(duì)冠狀病毒的研究自 2003 年 SARS 疫情出現(xiàn)后才逐漸受到關(guān)注，到目前為止 PUBMED 上能檢索到 1 萬(wàn)多篇關(guān)于冠狀病毒的研究論文或綜述，其中超過(guò) 60% 的文獻(xiàn)是圍繞 SARS 及 MERS 病毒的生物學(xué)特點(diǎn)或防控手段進(jìn)行的?？构跔畈《镜乃幬镅芯慷鄶?shù)始于篩選，篩選模型既有病毒感染的細(xì)胞模型也有酶水平的生化模型，篩選范圍大的可以包括數(shù)萬(wàn)個(gè)上市藥物或已知化合物，小的僅包括定向選擇的數(shù)個(gè)廣譜抗病毒化合物，得到的陽(yáng)性化合物結(jié)構(gòu)類(lèi)型較多，且更多出現(xiàn)在抗病毒劑或免疫調(diào)節(jié)劑中。隨著人類(lèi)對(duì)于冠狀病毒結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性質(zhì)的認(rèn)識(shí)不斷深入，基于病毒生命周期的全新藥物設(shè)計(jì)逐漸顯露，一類(lèi)是基于在病毒與受體結(jié)合以及融合過(guò)程中發(fā)揮重要作用的刺突蛋白關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，設(shè)計(jì)靶向病毒進(jìn)入的單克隆抗體藥物和抗病毒融合肽；另一類(lèi)是基于冠狀病毒 3CL 蛋白酶的催化結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)靶向病毒復(fù)制的擬肽類(lèi)或小分子蛋白酶抑制劑。這兩大類(lèi)抗病毒化合物具有機(jī)制清楚、抗病毒活性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，有些單克隆抗體的抗病毒活性已經(jīng)在動(dòng)物模型上得到了驗(yàn)證，因此研究進(jìn)展相對(duì)更深入。但是，單抗藥物的研發(fā)成本高、肽類(lèi)藥物的藥學(xué)性質(zhì)差都是毋庸置疑的問(wèn)題。因此，肽類(lèi)藥物向小分子抑制劑的優(yōu)化研究是現(xiàn)在有些團(tuán)隊(duì)的研究方向。除此之外，病毒存在抗原漂移和耐藥突變的問(wèn)題，很容易導(dǎo)致疫苗失效和特異性抗病毒藥物耐受。宿主靶點(diǎn)具有相對(duì)保守和廣譜抗病毒的特點(diǎn)，因此，在應(yīng)對(duì)新毒種或未知病毒突發(fā)狀況時(shí)，宿主靶向抗病毒藥物可能具有更廣闊的應(yīng)用空間?？傊S著新病毒變種的不斷暴發(fā)，抗冠狀病毒藥物研究必將吸引科學(xué)家和政府更多的研究投入，首個(gè)抗冠狀病毒特效藥物獲批上市值得期待。

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重大新藥創(chuàng)制“十三五”國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2017ZX 09201006-012）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（2016-I2M- 3-022）

李艷萍，Email：liyanping@imb.pumc.edu.cn

2020-03-23

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.001