潘 永，楊 陽(yáng)，楊 琦,3*

1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所，貴州貴陽(yáng) 550025；3.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025

長(zhǎng)順綠殼蛋雞作為貴州省優(yōu)勢(shì)蛋雞品種，具有耐粗飼、抗病力強(qiáng)、覓食能力強(qiáng)等特點(diǎn)，為了解該品種雞腸道優(yōu)勢(shì)益生菌群的特點(diǎn)以及篩選防治禽類(lèi)疾病的候選菌種，本研究將針對(duì)其糞便，通過(guò)嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定幾個(gè)方面對(duì)其優(yōu)勢(shì)型益生菌進(jìn)行初步的分離和鑒定[1]。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

貴州省長(zhǎng)順縣光輝綠殼蛋雞產(chǎn)業(yè)集團(tuán)采集的健康成年蛋雞糞便20 份，置于無(wú)菌封口袋中，-20 ℃保存。

1.2 試劑及耗材

MRS 培養(yǎng)基、PBS、厭氧培養(yǎng)包（1 000 mL）、革蘭氏染液。

1.3 分離純化培養(yǎng)

稱取糞便1 g 放入無(wú)菌10 mLPBS 緩沖液中攪拌均勻，用無(wú)菌紗布過(guò)濾雜質(zhì)。以濾液為原液，每次稀釋10 倍，分別用PBS 緩沖液稀釋3 次，保留包含原液的4 個(gè)稀釋梯度的樣品。分別取各樣品100 μL 用無(wú)菌三角玻璃棒涂布于MRS 培養(yǎng)基，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)包，密封后于37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

1.4 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

宏觀：選取20 份糞便樣品稀釋培養(yǎng)后MRS 培養(yǎng)基，記錄菌落數(shù)在30 ～100 的平板，挑選并標(biāo)記優(yōu)勢(shì)菌，優(yōu)勢(shì)菌應(yīng)同時(shí)具備以下特點(diǎn)：菌落總數(shù)最多，菌落形態(tài)較大。觀察優(yōu)勢(shì)菌透明度、形狀、邊緣、顏色、濕潤(rùn)與否、光滑或粗糙。微觀：酒精燈旁，釣菌環(huán)蘸取一滴無(wú)菌蒸餾水于無(wú)菌玻片中央，釣菌環(huán)挑取少量單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落與蒸餾水混合并以同心圓的形式擴(kuò)散涂布，玻片于酒精燈火焰上方來(lái)回烘干，吸取一滴結(jié)晶紫染料于玻片中央并晃動(dòng)使之覆蓋附著于玻片的細(xì)菌，30 ～60 s 后用無(wú)菌蒸餾水輕輕沖洗，吸取一滴碘液于同樣的位置并使其鋪開(kāi)，30 ～60 s 后無(wú)菌蒸餾水輕輕沖洗，吸取一滴95%乙醇脫色液于同樣位置并鋪開(kāi)，20 ～30 s 后無(wú)菌蒸餾水輕輕沖洗，吸取一滴沙皇復(fù)染色液于同樣位置并鋪開(kāi)，30 ～60 s 后蒸餾水輕輕沖洗，吸水紙從邊緣將玻片上多余的水吸干，酒精燈火焰上方將玻片烘干，吸取一滴松節(jié)油到玻片中央，于光學(xué)顯微鏡1 000 倍觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)登陸NCBI 網(wǎng)站，下載并分析現(xiàn)有益生菌16S rDNA 基因序列，以同源性最高的上游序列：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTNAG -3’為正向通用引物，同源性最高的下游序列：5’-GGTTACCTTGTTACGACT T-3’為反向通用引物，通過(guò)Touchdown PCR 技術(shù)擴(kuò)增20 份糞便樣品優(yōu)勢(shì)益生菌16S rDNA 基因序列。擴(kuò)增產(chǎn)物取10 μL 經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，膠回收送往上海勤邦生物有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 檢測(cè)，比對(duì)分析其在細(xì)菌中的分類(lèi)地位。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

對(duì)20 份樣品中優(yōu)勢(shì)益生菌的判斷發(fā)現(xiàn)，A1 菌株在8 份糞便樣品中被判定為優(yōu)勢(shì)菌，A2 在另外的6 份糞便樣品中被判定為優(yōu)勢(shì)菌，A3 則在剩下的6 份糞便樣品中被判定為優(yōu)勢(shì)菌。通過(guò)3 株優(yōu)勢(shì)益生菌進(jìn)行宏觀和微觀形態(tài)學(xué)對(duì)比，結(jié)果顯示，有3 株菌株表現(xiàn)為不同的微觀形態(tài)，其中A1 為革蘭氏陽(yáng)性菌，屬短桿菌，兩端鈍圓，成對(duì)，無(wú)芽孢。A2 為革蘭氏陽(yáng)性菌，屬長(zhǎng)桿菌，棒狀，成對(duì)，無(wú)芽孢。A3 為革蘭氏陽(yáng)性菌，屬中短型桿菌，兩端鈍圓，成對(duì)或鏈狀排列，無(wú)芽孢。

2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

通過(guò)通用引物對(duì)上述三株細(xì)菌16S rDNA 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示，除空白對(duì)照組外，均出現(xiàn)單一目的條帶，經(jīng)測(cè)序表明，A1 菌株16S rDNA 基因序列堿基數(shù)為1 469 bp，A2菌株16S rDNA 基因序列堿基數(shù)為1 450 bp，A3 菌株16S rDNA 基因序列堿基數(shù)為1 486 bp。

通過(guò)登錄NCBI 網(wǎng)站進(jìn)入BLAST 單元，導(dǎo)入上述3 種菌株16S rDNA 基因測(cè)序反饋序列，比對(duì)分析結(jié)果顯示，A1 菌株與羅伊乳桿菌具有最高的相似度，A2 菌株與黏膜乳桿菌具有最高的相似度，A3 菌株則與植物乳桿菌具有最高的相似度。以上結(jié)果表明，本研究成功從雞糞便中分離到3 株不同的益生菌菌株。

3 討論

細(xì)菌耐藥性一直以來(lái)均被視為世界衛(wèi)生體系中較為重要的問(wèn)題，同時(shí)對(duì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生了較為嚴(yán)重后果[2]。本研究中對(duì)20 份糞便樣品的分離鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三株益生菌分別為不同實(shí)驗(yàn)組別中的優(yōu)勢(shì)菌群。該結(jié)果提示，益生菌菌群的構(gòu)成較為復(fù)雜，正常腸道環(huán)境中并非僅有一種益生菌發(fā)揮作用，可能是多種，而益生菌群之間存在聯(lián)系與否，還需深入研究。