彭夢(mèng)玲 董 靜 劉 琦 胡文業(yè) 張粟子 王菊花 周 杰

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036)

因環(huán)境溫度超過(guò)等熱區(qū)(Thermoneutral zone)上限，導(dǎo)致動(dòng)物的非特異性反應(yīng)稱(chēng)為熱應(yīng)激[1]。熱應(yīng)激是制約肉雞養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)效率的主要因素之一[2]，主要表現(xiàn)在：肉雞在采食量、飼料轉(zhuǎn)化率、生長(zhǎng)速度的顯著下降；同時(shí)伴有生理機(jī)能紊亂的發(fā)生[3-4]。研究表明持續(xù)或間歇性高溫可對(duì)雞營(yíng)養(yǎng)代謝利用、腸道菌群、生理免疫等產(chǎn)生綜合負(fù)面影響[5-7]，尤其容易引起脂肪沉積[8-9]。

稀土殼糖胺螯合鹽(Rare earth-chitosan chelate，RECC)具有類(lèi)似抗生素作用，主要以稀土硝酸鹽與殼糖胺為原料，經(jīng)特殊電化學(xué)工藝加工而成，安全性高，是一種新型飼料添加劑[10]。RECC可提高禽類(lèi)和反芻動(dòng)物的飼料利用率，并促進(jìn)其體內(nèi)生長(zhǎng)因子和激素的釋放，進(jìn)一步增加機(jī)體免疫力[11-12]。RECC可促進(jìn)蛋雞新陳代謝，提高產(chǎn)蛋率[13]。

ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1(ATP binding cassette transporter G1，ABCG1)是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP binding cassette transporter，ABC)超家族中的一員。ABCG1通過(guò)消耗ATP介導(dǎo)蛋白質(zhì)、膽固醇、磷脂等多種物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，主要存在于細(xì)胞膜上[14]。已有研究表明ABCG1可介導(dǎo)膽固醇外排，并緩解巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)[15]。此外，ABCG1可通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)量積累防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[16,17]。熱應(yīng)激可導(dǎo)致脂肪沉積，ABCG1可抑制脂肪沉積。然而，RECC對(duì)熱應(yīng)激肉雞脂肪沉積的影響卻鮮有報(bào)道，且RECC是否影響熱應(yīng)激條件下ABCG1mRNA表達(dá)水平仍然未知。因此，本研究擬從脂肪組織學(xué)角度探討RECC對(duì)熱應(yīng)激條件下肉雞脂肪沉積的影響，以黃羽肉雞為研究對(duì)象，利用組織學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)方法，檢測(cè)RECC對(duì)熱應(yīng)激處理下皮下、肌內(nèi)和內(nèi)臟脂肪細(xì)胞大小及ABCG1mRNA表達(dá)的影響，以期探明RECC是否通過(guò)ABCG1mRNA表達(dá)的變化影響熱應(yīng)激導(dǎo)致的脂肪沉積，為RECC進(jìn)一步在禽類(lèi)熱應(yīng)激中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取90只1日齡黃羽肉雞(合肥立華畜禽有限公司)，按照飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)至29日齡，開(kāi)始進(jìn)行熱應(yīng)激處理。肉雞隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(飼養(yǎng)溫度25±0.05 ℃+基礎(chǔ)日糧)、熱應(yīng)激組(飼養(yǎng)溫度37±0.05 ℃+基礎(chǔ)日糧)和RECC組(飼養(yǎng)溫度37±0.05 ℃+基礎(chǔ)日糧+0.03% RECC)，每組30 只。熱應(yīng)激處理時(shí)間分別7 d和14 d。

1.2 主要試劑及儀器

稀土殼糖胺螯合鹽由武漢楚興國(guó)盛科技有限公司提供，稀土有效成分為鑭和鈰，稀土殼糖胺螯合鹽含量≥45%。Total RNA Kit II(OMEGA)、RNA Loading Buffer(上海生物工程有限公司)、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)、2×TaqPCR MasterMix(TIANGEN)、核酸染料(TIANGEN)、DNA Marker(TIANGEN)、5×TBE buffer(上海生物工程有限公司)。

主要儀器有：熒光倒置顯微鏡(37XB，上海光學(xué)儀器六廠)；PCR儀(MJ Mini伯樂(lè)，美國(guó))；高速冷凍離心機(jī)(2K-15，珠海黑馬科技有限公司)；高壓蒸汽鍋(SYQDSX-280，上海申安醫(yī)療器械廠)；酶標(biāo)儀(EON，美國(guó)伯騰儀器有限公司)；手掌型離心機(jī)(LX-100，江蘇其林貝兒儀器制造有限公司)。

1.3 采樣及切片制備

分別在熱應(yīng)激處理的第7 天和第14 天，每組隨機(jī)選取15 只雞進(jìn)行屠宰，屠宰前給雞禁食12 h，采集其皮下(頸部)、內(nèi)臟(肌胃周?chē)?和肌間(腿肌)脂肪組織，在Bouin液中固定24 h，進(jìn)行HE染色，染色程序如下：組織修塊(約為1.5 mm×1.5 mm×3 mm)后，放入脫水筐中，流水沖洗過(guò)夜；用梯度酒精進(jìn)行脫水，濃度依次為75%、85%、95%、95%、100%和100%，每個(gè)濃度45 min；將組織塊放入二甲苯溶液中約30 s，再放入盛有液體蠟的燒杯中浸蠟，60 ℃ 3 h；用鑷子取出組織塊，放入包埋筐中，并倒入溶化后的液體蠟，動(dòng)作要迅速；待蠟?zāi)毯?，?5 μm 厚度進(jìn)行切片，在50 ℃水中平展后粘附到載玻片上，并置于60 ℃恒溫箱中3 h；將含有組織的載玻片按照以下順序進(jìn)行染色：二甲苯溶液(10 min)、二甲苯溶液(10 min)、100%酒精(5 min)、95%酒精(5 min)、95%酒精(5 min)、85%酒精(5 min)、75%酒精(5 min)、蘇木精(5 min)、水中輕晃漂洗、1%鹽酸(5 s)、流水沖洗(10 min)、伊紅(1 min)、流水沖洗(1 min)、75%酒精(5 min)、85%酒精(5 min)、95%酒精(5 min)、95%酒精(5 min)、100%酒精(5 min)、二甲苯(5 min)、二甲苯(5 min)；封片，晾干后，用顯微鏡進(jìn)行拍照。

1.4 ABCG1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

脂肪組織總RNA提取方法參照OMEGA公司Total RNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)，利用Nandrop測(cè)定總RNA濃度和純度。取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系和參數(shù)設(shè)置參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。獲得cDNA后，對(duì)內(nèi)參基因及目的基因mRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析，即2-ΔΔCT法。本試驗(yàn)以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參，引物序列為：5′-AGACATCAGGGTGTGATGGTTGGT-3′(上游)，5′-TCCCAGTTGGTGACAATACCGTGT-3′(下游)，產(chǎn)物大小為125 bp。脂聯(lián)素引物序列為：5′-CTGGGTACAGGAGGAAGC-3′(上游)，5′-GAAGGACAAGGCAGTGATC-3′(下游)，產(chǎn)物大小為194 bp。ABCG1引物序列為：5′-AGATGAGGAAGGAGCATG-3′(上游)和5′-TCAGGGAAGTTCAGCAGT-3′(下游)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為203 bp。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共39 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系為20 μL。引物在Primer Prime 5.0軟件上設(shè)計(jì)，由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析

Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics Inc. Rockville MD，美國(guó))軟件計(jì)數(shù)單個(gè)視野中的脂肪細(xì)胞數(shù)目，并測(cè)量脂肪細(xì)胞直徑(μm)平均值(用像素點(diǎn)的數(shù)目表示)。每份標(biāo)本測(cè)量5 個(gè)視野。采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析方法為t檢驗(yàn)，分析結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。差異顯著為P<0.05，差異極顯著P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱應(yīng)激及RECC對(duì)不同部位脂肪細(xì)胞形態(tài)的影響

熱應(yīng)激分別處理黃羽雞1和2周后，皮下、肌內(nèi)和內(nèi)臟脂肪組織HE染色結(jié)果如圖1和圖2所示：

(a)皮下脂肪細(xì)胞；(b)內(nèi)臟脂肪細(xì)胞；(c)肌間脂肪細(xì)胞。Ⅰ 對(duì)照組；Ⅱ 熱應(yīng)激組；Ⅲ RECC組。(a) Subcutaneous adipocytes; (b) Visceral adipocytes; (c) Intermuscular adipocytes. Ⅰ Control group； Ⅱ Heat stress group； Ⅲ RECC group.圖1 各組黃羽肉雞熱應(yīng)激1周后脂肪組織HE染色結(jié)果對(duì)比(400×，標(biāo)尺=50 μm)Fig.1 HE staining of the fat tissues of yellow-feathered broilers treated with thermal stress for 1 week (400×, scale bar=50 μm)

(a)皮下脂肪細(xì)胞；(b)內(nèi)臟脂肪細(xì)胞；(c)肌間脂肪細(xì)胞。Ⅰ 對(duì)照組；Ⅱ 熱應(yīng)激組；Ⅲ RECC組。(a) Subcutaneous adipocytes; (b) Visceral adipocytes; (c) Intermuscular adipocytes. Ⅰ Control group； Ⅱ Heat stress group； Ⅲ RECC group。圖2 熱應(yīng)激2周脂肪組織HE染色結(jié)果(400×，標(biāo)尺=50 μm)Fig.2 Results of HE staining of fat tissues treated with thermal stress for 2 weeks (400×, scale bar=50 μm)

與對(duì)照組相比，肉眼可見(jiàn)各部位脂肪細(xì)胞直徑在熱應(yīng)激組有增大；經(jīng)RECC處理后，各部位脂肪細(xì)胞直徑減小，需進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。

2.2 熱應(yīng)激及RECC對(duì)不同部位脂肪細(xì)胞半徑的影響

為分析顯微鏡下觀察到的結(jié)果的準(zhǔn)確性，進(jìn)一步利用Image-Pro Plus 6.0分別對(duì)各處理組皮下、肌內(nèi)和內(nèi)臟脂肪細(xì)胞大小及數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表1。熱應(yīng)激1 周后，與對(duì)照組相比，肌間脂肪細(xì)胞直徑在熱應(yīng)激處理組增大了12.12%(P<0.01)；與熱應(yīng)激處理組相比，肌間脂肪細(xì)胞直徑在RECC處理組顯著減小了23.27%(P<0.01)。皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪細(xì)胞直徑在熱應(yīng)激處理組，與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化；而皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪細(xì)胞直徑在RECC處理組與熱應(yīng)激組相比分別減小了20.71%(P<0.01)和14.87%(P<0.01)。本研究結(jié)果表明熱應(yīng)激1 周可顯著增大肉雞肌間脂肪細(xì)胞直徑，對(duì)皮下和內(nèi)臟脂肪細(xì)胞直徑變化無(wú)顯著影響；RECC可顯著減小皮下和內(nèi)臟脂肪細(xì)胞直徑。

熱應(yīng)激2周后，皮下脂肪細(xì)胞直徑大小在各處理組均無(wú)顯著變化(表2)。與熱應(yīng)激組相比，內(nèi)臟脂肪細(xì)胞直徑大小在RECC處理組顯著減小了9.00%(P<0.05)；與對(duì)照組相比，肌間脂肪細(xì)胞直徑大小在熱應(yīng)激處理組顯著增大了12.83%(P<0.01)，而用RECC處理后與熱應(yīng)激組相比顯著減小了14.18%(P<0.01)。表明RECC對(duì)熱應(yīng)激處理兩周導(dǎo)致的內(nèi)臟和肌間脂肪細(xì)胞直徑增大具有一定抑制作用，而熱應(yīng)激和RECC對(duì)皮下脂肪細(xì)胞直徑無(wú)顯著影響。

表1 熱應(yīng)激1 周對(duì)黃羽肉雞各部位脂肪細(xì)胞直徑大小的影響Table 1 Effects of thermal stress on the diameter of fat cells of yellow-feathered broilers μm

表2 熱應(yīng)激2 周對(duì)黃羽肉雞脂肪細(xì)胞直徑大小的影響Table 2 Effects of two weeks of thermal stress on the diameter of fat cells in yellow-feathered broilers μm

2.3 熱應(yīng)激1周和2周黃羽肉雞內(nèi)臟脂肪、皮下脂肪、肌間脂肪脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)水平

熱應(yīng)激1周后，皮下脂肪、內(nèi)臟和肌間脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比，均顯著下降(P<0.05)；與熱應(yīng)激組相比，皮下脂肪和肌間脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平在RECC處理組顯著升高(P<0.05)(圖3)。脂聯(lián)素具有抑制脂肪沉積的作用，其表達(dá)水平在RECC處理組顯著升高，表明脂肪沉積被抑制(圖3)。

*和**分別代表組間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。下同。* and ** mean significant differences between groups at P<0.05 and P<0.01 levels，respectively．The same below.圖3 熱應(yīng)激1周各脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of adiponectin mRNA in different adipose tissue after one week of thermal stress

如圖4所示，熱應(yīng)激2 周后，內(nèi)臟脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比，顯著下降(P<0.05)，在肌間脂肪組織中極顯著下降(P<0.01)；與熱應(yīng)激組相比，肌間脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)。表明隨著熱應(yīng)激處理時(shí)間的延長(zhǎng)，熱應(yīng)激與RECC對(duì)肌間脂肪沉積的影響最為顯著。

圖4 熱應(yīng)激2周各脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of adiponectin mRNA in different adipose tissue after two weeks of thermal stress

2.4 熱應(yīng)激1周和2周黃羽肉雞內(nèi)臟脂肪、皮下脂肪、肌間脂肪ABCG1 mRNA的表達(dá)水平

如圖5所示，熱應(yīng)激1 周后，熱應(yīng)激組皮下脂肪和肌間脂肪ABCG1mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，RECC組皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪ABCG1mRNA的表達(dá)量顯著高于熱應(yīng)激組(P<0.05)，極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，RECC組肌間脂肪ABCG1mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖5 熱應(yīng)激1周RECC對(duì)各脂肪組織中ABCG1基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of RECC on the expression of ABCG1 mRNA in different adipose tissue after one week of thermal stress

圖6 熱應(yīng)激2周后RECC對(duì)不同脂肪組織中ABCG1基因表達(dá)的影響Fig.6 Effect of RECC on the expression of ABCG1 gene in different adipose tissue after two week of thermal stress

如圖6所示，熱應(yīng)激2 周后，皮下脂肪熱應(yīng)激組ABCG1mRNA的表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組和RECC組(P<0.01)，內(nèi)臟脂肪熱應(yīng)激組ABCG1mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和RECC組(P<0.05)，肌間脂肪熱應(yīng)激組ABCG1mRNA的表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

3 討論與結(jié)論

3.1 熱應(yīng)激對(duì)肉雞脂肪細(xì)胞大小的影響

脂肪過(guò)度沉積影響胴體品質(zhì)和人類(lèi)健康[18]，熱應(yīng)激可促進(jìn)肉雞脂肪合成并導(dǎo)致脂肪沉積。Ain等[19]研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度為32 ℃時(shí)，4～7周齡肉雞腹脂、皮下脂肪和肌間脂肪沉積率分別增加15%、21%和22%(以活體重計(jì))。脂肪細(xì)胞的增大和增殖導(dǎo)致脂肪沉積，動(dòng)物在胚胎期脂肪組織的生長(zhǎng)發(fā)育主要由于前脂肪細(xì)胞的增生，在出生后主要是脂肪細(xì)胞的肥大[20]。CLA減少腹脂沉積主要是通過(guò)抑制脂肪細(xì)胞肥大而不是脂肪細(xì)胞增殖。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激處理1和2周后，肌間脂肪細(xì)胞直徑與對(duì)照組相比顯著增加，表明熱應(yīng)激可顯著增大肌間脂肪細(xì)胞[21-22]。

3.2 RECC對(duì)熱應(yīng)激條件下脂肪細(xì)胞大小的影響

RECC具有類(lèi)似于纖維素的結(jié)構(gòu)，在動(dòng)物體內(nèi)可以結(jié)合飼糧中的脂肪，形成膠體，從而降低脂肪在體內(nèi)的消化吸收；或者通過(guò)提高卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶的活性和調(diào)節(jié)前體物的合成量；達(dá)到降低脂肪沉積的作用[23]。RECC通過(guò)影響超氧化物歧化酶活性調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化水平，但其對(duì)脂肪細(xì)胞大小變化的影響仍不清楚[24]。為探討RECC對(duì)熱應(yīng)激條件下脂肪細(xì)胞大小的變化，本研究在飼料中添加RECC測(cè)定其對(duì)熱應(yīng)激條件下肉雞脂肪細(xì)胞大小的影響，結(jié)果顯示熱應(yīng)激1周后RECC可顯著減小皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪細(xì)胞直徑(P<0.01)，而熱應(yīng)激2周RECC對(duì)熱應(yīng)激處理導(dǎo)致的內(nèi)臟和肌間脂肪細(xì)胞直徑增大具有一定抑制作用，對(duì)皮下脂肪細(xì)胞直徑無(wú)顯著影響。表明RECC對(duì)各部位脂肪細(xì)胞的影響與熱應(yīng)激處理時(shí)間密切相關(guān)。皮下脂肪細(xì)胞直徑隨熱應(yīng)激處理時(shí)間的延長(zhǎng)不易被RECC影響。

3.3 RECC和熱應(yīng)激對(duì)ABCG1 mRNA表達(dá)水平的影響

ABCG1是一種脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體，其活化或過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流[25]。Haung等[26]研究發(fā)現(xiàn)，ABCG1通過(guò)升高細(xì)胞內(nèi)高密度脂蛋白(HDL)的濃度，促進(jìn)膽固醇外排，從而緩解或抑制動(dòng)脈粥樣硬化。Ooi等[27]和薛嘉虹等[28]研究發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激情況下，ABCG1的表達(dá)量上調(diào)，通過(guò)膽固醇外排，從而減少血管內(nèi)脂肪沉積。在本研究中發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激可導(dǎo)致脂肪細(xì)胞的增大，進(jìn)一步導(dǎo)致脂肪沉積，RECC可緩解熱應(yīng)激導(dǎo)致的脂肪細(xì)胞增大。因此，本研究探討RECC和熱應(yīng)激對(duì)ABCG1mRNA表達(dá)水平的影響。在熱應(yīng)激條件下，ABCG1mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，表明ABCG1mRNA通過(guò)脂質(zhì)外排，抑制應(yīng)激條件下脂肪沉積。熱應(yīng)激1 周后RECC組各脂肪組織中ABCG1mRNA表達(dá)水平均顯著高于熱應(yīng)激組，說(shuō)明RECC在熱應(yīng)激條件下抗脂肪沉積作用機(jī)制之一，可能與上調(diào)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)基因ABCG1mRNA的表達(dá)水平有關(guān)。值得關(guān)注的是，在熱應(yīng)激2 周，RECC組ABCG1mRNA表達(dá)水平趨于對(duì)照組，表明隨著RECC的持續(xù)加入脂肪沉積得到抑制。關(guān)于RECC與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)基因ABCG1mRNA表達(dá)水平的不同機(jī)制及其能否增加膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)率有待深入研究。

綜上所述，RECC可通過(guò)減小脂肪細(xì)胞直徑和促進(jìn)ABCG1mRNA的表達(dá)抑制熱應(yīng)激肉雞體內(nèi)脂肪沉積。