張洲，操孫潤，武晉英，馬孟濤，宋曉宇

（中國醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，沈陽 110122）

結(jié)腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率已居全球第3位，死亡率也位于惡性腫瘤前列［1］。由于結(jié)腸癌細(xì)胞具有快速增殖能力和轉(zhuǎn)移能力，結(jié)腸癌的發(fā)病率和致死率呈逐年上升趨勢(shì)。近年研究表明，免疫基因在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，探討免疫相關(guān)基因和蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞中的功能和作用，對(duì)結(jié)腸癌的防治具有重要意義。包含SAM和HD結(jié)構(gòu)域的1型蛋白（sterile alpha motif and histidine-aspartic acid domain containing protein 1，SAMHD1）是一種脫氧核苷酸三磷酸水解酶，在維持細(xì)胞脫氧核糖核苷酸穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用［2-3］。SAMHD1蛋白首次發(fā)現(xiàn)于樹突狀細(xì)胞，細(xì)胞SAMHD1基因突變會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫性疾病，如Aicardi-Goutières綜合征、系統(tǒng)性狼瘡、腦萎縮、癌癥等［4］。常間回文重復(fù)序列叢集（clustered regularly interspaced palindromic repeat，CRISPR）/常間回文重復(fù)序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白9（CRISPR-associated protein，Cas9）系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌形成的一種免疫防御系統(tǒng)，利用單向?qū)NA（single-guide RNA，sgRNA）介導(dǎo)的Cas9 蛋白對(duì)基因組DNA進(jìn)行特異性切割，從而達(dá)到更好的基因編輯作用，可幫助研究人員了解疾病分子機(jī)制［5-7］。為了探究SAMHD1蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能和分子機(jī)制，本研究通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除SAMHD1基因，構(gòu)建了SAMHD1基因敲除的HCT116人源結(jié)腸癌細(xì)胞株，進(jìn)一步檢測(cè)SAMHD1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響，為深入研究SAMHD1在結(jié)腸癌細(xì)胞中作用的分子機(jī)制提供可選模型和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

pYSY-CMV-Cas9-EF1α-Puromycin質(zhì)粒購自南京堯順禹生物科技有限公司；人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116）購自于美國ATCC公司；T4 連接酶、E.coliDH5α購自日本TaKaRa公司；Tubofect transfection試劑購自美國Thermo Scientific公 司；anti-SAMHD1、β-actin抗體購自美國CST公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒、細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒、嘌呤霉素、IMDM培養(yǎng)基、限制性內(nèi)切酶BbsⅠ均購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 人源SAMHD1基因結(jié)構(gòu)分析及靶點(diǎn)設(shè)計(jì)：在美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫里找到人源SAMHD1的mRNA，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x定目標(biāo)結(jié)構(gòu)域cd00077，找到該結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的氨基酸序列中第一個(gè)M及核苷酸序列中對(duì)應(yīng)的起始密碼子，確定該起始密碼子所在的外顯子，輸入預(yù)測(cè)sgRNA網(wǎng)站（http：//crispr.mit.edu）進(jìn)行預(yù)測(cè)。選取最高分引物：上游引物，5’-CACCGTATTCCACTTGCTCGCCCGG-3’；下游引物，5’-AAACCCGGGCGAGCAAGTGGAATAC-3’。在核酸序列nucleotide中找到sgRNA序列位置，并找到合適的鑒定引物位置，再使用DNACLUB進(jìn)行檢測(cè)，觀察GC比例等。設(shè)計(jì)鑒定引物：上游引物，5’-GGCAACAAGAGCGAAACTCCGTCT-3’；下游引物，5’-CAGTGTCCAGGGTGCTTTCATTCACA-3’。

1.2.2 pYSY-CMV-Cas9-EF1α-Puromycin-sgRNASAMHD1重組質(zhì)粒構(gòu)建及克?。菏褂孟拗菩詢?nèi)切酶BbsⅠ酶切質(zhì)粒使pYSY-CMV-Cas9-EF1α-Puromycin線性化，隨后切膠回收。將合成的單鏈sgRNA常規(guī)退火后形成雙鏈，用T4連接酶將之與純化后的線性質(zhì)粒連接。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)中，涂于 AMP抗性的LB平板上。過夜培養(yǎng)后，挑取數(shù)個(gè)單菌落，送樣測(cè)序，比對(duì)測(cè)序結(jié)果，選取含有正確的重組質(zhì)粒的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行中提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清及青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 U/mL）的IMDM 培養(yǎng)基，將HCT116細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2孵箱進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)將細(xì)胞接種于6孔板，約2.5×105/孔，設(shè)置Cas9-vector組和Cas9-SAMHD1組，各3個(gè)復(fù)孔。將9 μg Cas9-vector質(zhì)粒和9 μg Cas9-SAMHD1重組質(zhì)粒分別加入2個(gè)1.5 mL EP管，分別加入20 μL轉(zhuǎn)染試劑Tubofect transfection和900 μL無血清培養(yǎng)基，混勻后分別取300 μL混合物，加入6孔板細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后，用嘌呤霉素1.5 μg/mL篩選，3 d后將篩選的混合細(xì)胞的1/2凍存，剩下的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，待狀態(tài)良好，進(jìn)行梯度稀釋后接種于96孔板中，培養(yǎng)10 d后挑選單克隆細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.4 TA克隆測(cè)序：取培養(yǎng)10 d后96孔板中的單克隆細(xì)胞置于48孔板、24孔板、6孔板，最后鋪于10 cm培養(yǎng)皿中，取1/4提取基因組，然后進(jìn)行PCR，采用TA克隆試劑盒對(duì)PCR引物進(jìn)行TA克隆后送測(cè)序。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)SAMHD1蛋白水平：將選定的單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，使用細(xì)胞裂解液（1%NP40）裂解細(xì)胞，提取蛋白并定量。利用SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白后，采用恒壓80 V電壓轉(zhuǎn)膜120 min，用5%牛血清白蛋白封閉液室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃過夜，次日TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min，加入二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次15 min，采用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白水平。

1.2.6 檢測(cè)DNA損傷指標(biāo)γH2AX并采用CCK-8法和光學(xué)顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞增殖：分別將單克隆細(xì)胞傳代至2個(gè)10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，分別給予PBS（對(duì)照組）和0.5 mmol/L阿霉素（DNA損傷組），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)DNA損傷指標(biāo)γH2AX。以2.5×103/孔的密度將細(xì)胞接種至96孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜，待完全貼壁后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行分組（Cas9-vector組和Cas9-SAMHD1組），每組3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72 h后，加入CCK-8試劑（5.0 g/L）10 μL/孔，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各組吸光度，并比較各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞數(shù)量。將Cas9-vector組和Cas9-SAMHD1組的3個(gè)復(fù)孔450 nm處的吸光度值取平均值，用來表示細(xì)胞增殖能力的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)打靶成功構(gòu)建靶向敲除SAMHD1的CRISPR/Cas9載體體系

利用 BbsⅠ酶對(duì)pYSY-CMV-Cas9-EF1α-Puromycin進(jìn)行線性化處理后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，見圖1A。將合成的sgRNA-SAMHD1引物配制成100 mmol/L的保存濃度，經(jīng)過退火后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，見圖1B。待成功后，連接到已線性化的pYSY-CMV-Cas9-EF1α-Puromycin，并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖1C。

圖1 利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)打靶構(gòu)建基因敲除質(zhì)粒圖Fig.1 Images of gene knockout plasmids by CRISPR/Cas9 system targeting technology

2.2 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構(gòu)建敲除SAMHD1基因的HCT116細(xì)胞株

通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)敲除SAMHD1基因后Cas9-SAMHD1組和Cas9-vector組中HCT116細(xì)胞的SAMHD1蛋白表達(dá)水平，見圖2。結(jié)果證明，敲除SAMHD1基因后Cas9-SAMHD1組SAMHD1蛋白表達(dá)水平在72×103位置條帶亮度明顯較低，SAMHD1蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.026±0.003；而Cas9-vector組SAMHD1蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.064±0.006，表明靶向敲除SAMHD1基因的HCT116 Cas9-SAMHD1細(xì)胞株構(gòu)建成功。

2.3 驗(yàn)證敲除SAMHD1基因的穩(wěn)定HCT116細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力較對(duì)照組細(xì)胞增強(qiáng)

圖2 Western blotting檢測(cè)HCT116細(xì)胞中SAMHD1蛋白的表達(dá)Fig.2 Western blotting results of SAMHD1 protein expression in HCT116 cells

通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Cas9-SAMHD1組和Cas9-vector組DNA損傷指標(biāo)γH2AX的表達(dá)水平，見圖3。結(jié)果顯示，Cas9-SAMHD1組的γH2AX表達(dá)水平在15×103位置條帶亮度明顯較低，未給予阿霉素時(shí)和給予阿霉素4 h后γH2AX蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.140±0.013和0.201±0.007；而Cas9-vector組未給予阿霉素時(shí)和給予阿霉素4 h后γH2AX蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.119±0.006和0.465±0.016。結(jié)果表明，Cas9-SAMHD1組細(xì)胞抵抗DNA損傷的能力增強(qiáng)。

2.4 敲除SAMHD1基因后HCT116細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組顯著增強(qiáng)

圖3 Western blotting檢測(cè)HCT116細(xì)胞中γH2AX蛋白表達(dá)Fig.3 Western blotting results of γH2AX protein expression in HCT116 cells

記錄4個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0、24、48、72 h）的細(xì)胞數(shù)量，放大倍數(shù)為10倍，見圖4。光鏡結(jié)果顯示，Cas9-SAMHD1組細(xì)胞增殖能力較Cas9-vector組增強(qiáng)。計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）=Cas9-SAMHD1組存活細(xì)胞數(shù)量/ Cas9-vector組存活細(xì)胞數(shù)量×100。Cas9-SAMHD1組與Cas9-vector組相比，細(xì)胞存活率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜ 0.01），見圖5。CCK-8結(jié)果顯示，Cas9-SAMHD1組細(xì)胞增殖能力較Cas9-vector組明顯增強(qiáng)。

圖4 HCT116細(xì)胞數(shù)量的變化 ×10Fig.4 Changes of HCT116 cells number ×10

3 討論

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建靶向敲除SAMHD1基因的HCT116細(xì)胞株，并證實(shí)該細(xì)胞株的增殖能力和抵抗DNA損傷的能力均較對(duì)照組顯著增強(qiáng)。

從2012年起，CRISPR/Cas9系統(tǒng)被發(fā)展成為基因編輯工具，并被廣泛用于多項(xiàng)科研和醫(yī)療領(lǐng)域。通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可實(shí)現(xiàn)單個(gè)基因、位點(diǎn)的特異性突變，從而使特定基因完全喪失生物學(xué)功能［8-9］。通過利用sgRNA和Cas9蛋白，CRISPR/Cas9系統(tǒng)便可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的識(shí)別和精確編輯。在很多方面該技術(shù)要明顯優(yōu)于其他基因編輯技術(shù)，尤其體現(xiàn)在其易于操作、效率高、周期短、工作量小、成本低等方面，并且可以在不同的位點(diǎn)同時(shí)引入多個(gè)突變，這是其他基因編輯技術(shù)不易做到的［10-11］。

圖5 HCT116細(xì)胞存活率的比較Fig.5 Comparison of survival rate of HCT116 cells

近年來，研究［12-15］證實(shí)SAMHD1是一種高效的dNTP水解酶，通過調(diào)控脫氧核糖核苷三磷酸的含量來維持基因組的穩(wěn)定，并且可能通過降低細(xì)胞內(nèi)的dNTP水平來抑制細(xì)胞增殖。研究［16］發(fā)現(xiàn)，SAMHD1在肺癌細(xì)胞中過表達(dá)后，可抑制核苷酸的形成和肺癌細(xì)胞的擴(kuò)散，這提示SAMHD1可能與腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)。與此同時(shí)，KODIGEPALLI等［17］發(fā)現(xiàn)，外源性SAMHD1表達(dá)通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在一定程度上抑制了皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。這提示SAMHD1在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中可能起抑制作用。本研究通過CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)成功敲除結(jié)腸癌細(xì)胞中SAMHD1，發(fā)現(xiàn)敲除SAMHD1后，結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活力顯著增強(qiáng)，并且能夠抵抗DNA損傷。

綜上所述，SAMHD1基因參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和DNA損傷修復(fù)反應(yīng)。本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步了解SAMHD1在HCT116細(xì)胞以及其他腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能及分子機(jī)制。