李美璇，董炳超，王曉銀，程希，趙傳勝，趙珊珊

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110001）

強制性運動療法（constraint-induced movement therapy，CIMT）是在生活環(huán)境中一定程度上限制患者使用健側的肢體，從而強制其反復使用患肢的療法。CIMT已被廣泛地應用于康復領域，并在臨床試驗中被證實能夠有效地促進腦卒中后患者的肢體功能恢復［1-2］。前期腦缺血動物實驗［3-6］發(fā)現(xiàn)，CIMT除了能夠促進腦缺血后大鼠的運動功能恢復，還能夠顯著地增加腦缺血后的神經(jīng)再生與軸突再生，并促進腦缺血后認知功能的恢復。目前對于CIMT改善腦缺血后大鼠認知功能的作用機制尚無相關研究報道。已有許多研究［7-10］表明，沉默信息調節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）在改善腦缺血后認知功能方面具有重要的作用，本研究通過檢測CIMT對腦缺血后大鼠海馬區(qū)域SIRT1及BDNF表達的影響來探討其改善腦缺血后大鼠認知功能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及分組

成年雄性Wistar大鼠（200～250 g）購自北京維通利華實驗技術有限公司，維持飼養(yǎng)環(huán)境室溫25 ℃左右，術前12 h禁食，自由飲水。內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）購自美國Sigma公司；SIRT1以及BDNF抗體購自美國Abcam公司；Alexa 568、Alexa488 免疫熒光二抗購自美國Invitrogen公司。將大鼠隨機分為3組：假手術組（Sham組）、缺血組（ISC組）、缺血后給予CIMT組（ISC+CIMT組），每組8只。

1.2 方法

1.2.1 大鼠局灶性腦缺血模型制備［5］：參照大鼠腦解剖圖譜，使用立體定位儀將ET-1注射到大鼠大腦皮質運動區(qū)及紋狀體區(qū)域以制作局灶性腦缺血模型。使用微量注射器將ET-1（0.5 μL/min）注入以下3個位點［2 μL/點，前囟為中心向側方（mediolateral，ML）、前囟為中心向前方（anteroposterior，AP）、前囟為中心向下方（dorsoventral，DV）］［11］，（1）AP=0.7 mm，ML=2.2 mm，DV=-2.0 mm；（2）AP=2.3 mm，ML=2.5 mm，DV=-2.3 mm；（3）AP=0.7 mm，ML=3.8 mm，DV=-5.8 mm。每個位點注射 2次，每次1 μL，間隔1 min。每位點注射完畢將注射器針頭在針道內(nèi)停留3 min，然后緩慢拔出。Sham組在相同的位點注射等量的生理鹽水。注射ET-1大鼠清醒后，若大鼠出現(xiàn)提尾倒懸時右上肢向胸前屈曲或行走時向右側傾倒或者向右側轉圈，且癥狀持續(xù)超過24 h，則可判定為腦缺血模型制作成功。

1.2.2 大鼠腦缺血后CIMT模型：參照以往實驗［5］，術后1周開始將大鼠上部軀干及梗死病灶同側前肢緊靠胸骨置于自然回縮姿勢，采用石膏繃帶進行固定，以此來限制大鼠健側前肢的活動，建立CIMT模型，持續(xù)3周。

1.2.3 免疫熒光染色：采用免疫熒光染色方法檢測海馬齒狀回（dentate gyrus，DG），CA1和CA3區(qū)SIRT1和BDNF的表達情況。冰凍切片（厚度10 μm）免疫熒光染色采用貼片法在室溫下進行。切片先復溫30 min，后在丙酮內(nèi)固定15 min，固定結束在0.01 mol/L PBS浸洗后依次加入75%、85%、95%和100%乙醇各5 min水化。然后用0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次5 min。SIRT1冰凍切片在pH=6.0的檸檬酸鹽修復液中高溫高壓修復2 min后冷卻至室溫。BDNF冰凍切片在pH9.0的Tris-EDTA修復液中加熱，直至修復液中出現(xiàn)氣泡，停止加熱并計時5 min，重復上述步驟3次。兩種抗原修復后切片均在0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次5 min。之后用抗原封閉液（0.01 mol/L PBS，0.4%Triton X-100和10%山羊血清）孵育50 min后加一抗（mouse anti-SIRT1抗 體1∶400；Rabbit anti-BDNF抗體1∶400），在抗體稀釋液中4 ℃過夜。一抗過夜后0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min，熒光共軛二抗（Alexa Fluor 568 Goat anti-Mouse 1∶200；Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit 1∶200）避光孵育2 h，避光條件下用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min。DAPI孵育5 min后再用PBS避光漂洗3次，每次5 min。最后使用抗熒光淬滅封片劑封片。

1.2.4 圖像處理與分析：采用激光共聚焦顯微鏡及其成像系統(tǒng)（日本Olympus，F(xiàn)V-1000）觀測ISC組及ISC+CIMT組大鼠缺血側以及Sham組大鼠注水側的海馬DG、CA1及CA3區(qū)SIRT1和BDNF的表達。同時對每只大鼠海馬DG 區(qū)、CA3區(qū)、CA1區(qū)隨機選取的3個部位進行激光薄層掃描，然后對Z軸系列圖層進行三維重建。用NIH ImageJ軟件對目標染色進行光密度值統(tǒng)計，其光密度值代表SIRT1和BDNF的表達水平。

1.2.5 水迷宮實驗［6］：大鼠腦缺血術后31 d，采用Morris水迷宮（淮北正華生物儀器設備有限公司）及圖像分析系統(tǒng)（美國HVS Image公司）對大鼠進行認知功能測試。定位航行實驗即分別從水迷宮4個象限的池壁中點將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠在120 s內(nèi)從入水到登上平臺所需時間（逃避潛伏期）。每次任務的起點都要改變，而且平臺的位置每天都被更換，連續(xù)進行3 d，逃避潛伏期和大鼠找到平臺前游泳的距離被用來評價水迷宮的成績。最后1 d定位航行實驗結束后將平臺撤離進行空間探索實驗，記錄目標象限60 s內(nèi)大鼠穿越原來平臺所在位置的次數(shù)及游泳軌跡。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠海馬SIRT1表達水平的比較

免疫熒光染色結果顯示，ISC組大鼠海馬DG區(qū)、CA1區(qū)、CA3區(qū)SIRT1的表達水平與Sham組相比均無統(tǒng)計學差異（均P＞ 0.05）。ISC+CIMT組大鼠海馬DG區(qū)、CA1區(qū)SIRT1的表達較ISC組均顯著增加（P＜0.01，P＜ 0.05）。而ISC+CIMT組海馬CA3區(qū)SIRT1的表達水平較ISC組有增高趨勢，但沒有統(tǒng)計學差異（P＞ 0.05）。見圖1。

圖1 腦缺血后33 d各組大鼠海馬各區(qū)SIRT1的表達情況（DG×100，CA1×400，CA3×200）Fig.1 Immunofluorescence staining of SIRT1 expression in the hippocampus of the rats in each group，33 days after cerebral ischemia（DG×100，CA1×400，CA3×200）

2.2 各組大鼠海馬區(qū)域BDNF表達水平的比較

免疫熒光染色結果顯示，ISC組海馬DG、CA1區(qū)的BDNF表達水平較Sham組有增多趨勢，ISC+CIMT組海馬DG和CA1區(qū)BDNF的表達較ISC組有減少趨勢，但3組間海馬DG、CA1區(qū)BDNF的表達水平?jīng)]有統(tǒng)計學差異（均P＞ 0.05）。見圖2。

ISC組海馬CA3區(qū)BDNF的表達水平與Sham組比較無統(tǒng)計學差異（P＞ 0.05）；ISC+CIMT組海馬CA3區(qū)BDNF的表達較ISC組略減少，但2組差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。見圖2。

2.3 水迷宮實驗結果

重復測量方差分析結果顯示，各組大鼠水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期具有統(tǒng)計學差異（F=11.80，P＜ 0.01）。與Sham組比較，ISC組大鼠逃避潛伏期明顯增加（P＜ 0.01），給予CIMT后可以明顯降低缺血后大鼠逃避潛伏期（P＜ 0.05）。單因素方差分析結果也提示在定位航行實驗的第2天和第3天，ISC組大鼠逃避潛伏期較Sham組明顯增加（P＜0.01），ISC+CIMT 組大鼠的逃避潛伏期較ISC組明顯減低（P＜ 0.05）。空間探索實驗結果提示ISC組大鼠在60 s內(nèi)穿越平臺所在位置的次數(shù)較SHAM組大鼠明顯減少（P＜ 0.01），ISC+CIMT組大鼠穿越平臺所在位置的次數(shù)較ISC組明顯增加（P＜ 0.01），見表1。

3 討論

本研究大鼠行為學測試結果顯示，ISC組大鼠認知功能較Sham組明顯下降，腦缺血后CIMT治療可以顯著改善腦缺血后大鼠的學習記憶功能。免疫熒光檢測結果顯示CIMT能夠顯著提高腦缺血后大鼠海馬DG和CA1區(qū)SIRT1的表達水平；腦缺血后海馬DG和CA1區(qū)BDNF的表達較Sham組有增加趨勢，CIMT治療在一定程度上減少了腦缺血后BDNF的表達。

圖2 腦缺血后33 d各組大鼠海馬各區(qū)BDNF的表達情況（DG×100，CA1×400，CA3×200）Fig.2 Immunofluorescence staining of BDNF expression in the hippocampus of the rats in each group，33 days after cerebral ischemia（DG×100，CA1×400，CA3×200）

表1 各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺所在位置的次數(shù)比較Tab.1 Comparison between the escape latency and times of crossing the platform for rats in each group

近年來，SIRT1對神經(jīng)系統(tǒng)的調控作用引起了人們的廣泛關注，多項研究［12-14］表明SIRT1在突觸可塑性和記憶的形成發(fā)揮關鍵作用。SIRT1是一類進化上保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的組蛋白去乙酰化酶家族成員之一，是廣泛存在于哺乳動物中NAD+依賴的去乙?；福诓溉閯游锏哪X神經(jīng)元中高度表達，可通過增加線粒體再生、抗凋亡、調節(jié)轉錄水平等機制對神經(jīng)元進行修復［15-16］。有研究［17-18］報道康復運動可通過提高大腦SIRT1的表達抵抗衰老，動物實驗表明跑臺運動可能通過激活SIRT1通路改善阿爾茨海默病轉基因小鼠的認知功能。本研究結果提示CIMT可以顯著改善腦缺血后大鼠的水迷宮測試成績，同時增加腦缺血后大鼠海馬各區(qū)域SIRT1的表達，說明CIMT可能是通過SIRT1相關通路起到促進腦缺血后認知功能恢復的作用。

BDNF是一個對運動訓練敏感的促進神經(jīng)再生和突觸發(fā)生的因子，在腦組織廣泛表達，特別是在海馬區(qū)，對學習和記憶形成有重要作用。BDNF可能參與改善大腦認知功能［19］。

有研究［20-21］表明SIRT1可通過調節(jié)甲基-CpG結合蛋白2與BDNF基因啟動子的結合狀態(tài)調控BDNF的轉錄來改善認知。另外SIRT1也可通過與包含轉錄因子的抑制復合物相互作用而減少miR-134表達，最終促進BDNF以及環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白的表達，從而促進長時程增強效應形成介導學習記憶功能。本研究結果提示腦缺血后大鼠DG及CA1區(qū)BDNF的表達較Sham組增加，ISC+CIMT組大鼠海馬各區(qū)域BNDF的表達較ISC組有減低趨勢，但差異均沒有統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05），可能是因為樣本量過小或者各組內(nèi)樣本差異過大所致。CIMT減少腦缺血后BDNF的表達究其原因可能是采用CIMT固定大鼠健側肢體會引起大鼠緊張，長期處于緊張壓力狀態(tài)導致慢性應激會影響腦缺血大鼠海馬BDNF的表達。已有研究證實自主運動可明顯促進腦缺血后大鼠海馬BDNF的表達，同時使大鼠表現(xiàn)出更少的皮質醇應激反應，而給予強制性運動后大鼠的血清皮質醇濃度較自主運動組大鼠明顯增高，其體內(nèi)高應激反應抑制了海馬BDNF的表達［22-23］。

本研究結果表明，CIMT雖然增加了SIRT1的表達，但并不是通過SIRT1-BDNF通路來起到改善腦缺血后認知功能的作用。SIRT1可以通過多種機制對缺血保護起重要作用，主要包括促進線粒體功能并抗氧化、DNA修復、改善突觸功能，參與NAD+代謝的神經(jīng)保護以及調節(jié)血液流動和神經(jīng)炎癥［9］。還有研究［24］證實褪黑素可以通過SIRT1-FoxO1通路改善認知。FoxO1是自噬調節(jié)的主要調節(jié)因子，其介導的自噬能夠改善血管性癡呆模型大鼠的認知功能［25］。近些年的動物模型相關實驗［26］也顯示自噬對血管性癡呆模型的大鼠起神經(jīng)保護作用。CIMT是否通過SIRT1相關的其他通路改善腦缺血后大鼠認知功能，需要將來進一步研究加以驗證。

綜上所述，本研究從形態(tài)學角度結合行為學測試探討了CIMT對腦缺血后大鼠認知功能改善的作用及可能的作用機制。證實了 CIMT可以顯著改善腦缺血后的認知功能障礙，且CIMT可能通過SIRT1相關信號通路發(fā)揮其改善腦缺血后大鼠認知功能的作用，SIRT1通路下游的具體作用機制還需進一步探索。

本研究結果對于深入了解腦缺血后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自我修復能力具有重要的意義，并為腦梗死后的認知功能恢復提供了新的理論基礎和治療靶點。