劉文欣,馮 芳,2

（1中國藥科大學藥物分析教研室，江蘇 南京 210009；2藥物質量與安全預警教育部重點實驗室，江蘇 南京 210009）

中藥經典名方因其確切的療效和較小的毒副作用,從古至今一直沿用,并且被世界上越來越多的國家所接受,中藥現(xiàn)代化和國際化是大勢所趨[1]。目前,針對中藥的研究越來越多,包括中藥的質量標準研究,活性成分研究,藥效及毒性物質基礎研究等,在這之中,中藥體內代謝物的鑒別是關鍵一環(huán),這對于了解中藥在體內的吸收代謝過程和闡明其藥效物質基礎具有重要意義[2]。

然而,在傳統(tǒng)的中藥代謝物鑒別過程中仍然存在著諸多問題:首先,中藥體系復雜,化合物種類多,且進入體內后需要經歷復雜多樣的代謝過程；其次,吸收入血成分及代謝物成分含量非常低,常規(guī)檢測方法難以滿足；最后,生物基質復雜,代謝物的鑒別過程受到內源性物質的干擾[3]。

為了解決上述困境,科研工作者做出了很多的努力,越來越多的高精密儀器和新策略涌現(xiàn)出來。其中,高分辨質譜(HRMS）應運而生[4],并且基于HRMS衍生出了很多代謝物鑒別的新策略,下文將對目前比較常用的基于HRMS的中藥代謝物策略綜述,分析各個策略的優(yōu)劣,以期建立更加高效、可靠的中藥代謝物鑒別策略。

1 高分辨質譜（HRMS）的介紹

1.1 HRMS的原理

高分辨質譜由真空系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、離子源、質量分析器以及檢測接收器幾部分構成,其原理與其他類型的質譜一樣,也是先將物質離子化,并按照質荷比分離,最后通過測定各離子峰的強度達到分析目的[5]。目前使用較多的高分辨質譜,主要包括飛行時間質譜(TOF-MS）、傅里葉變換離子回旋共振質譜(FTICR-MS）和靜電場軌道阱質譜(Orbitrap-MS）等,并且均可以和四級桿或離子阱相串聯(lián)以提高其性能[4]。

TOF-MS通過固定離子飛行距離,根據(jù)不同質量離子的飛行時間不同,從而到達檢測器的時間不同,質量小的先到達,從而實現(xiàn)對不同質量離子的檢測,具有快速、高靈敏度和高分辨率的特點[6]。FTICR-MS是一種根據(jù)給定磁場中的離子回旋頻率來測量離子質荷比的質譜分析器,具有極高的分辨率,在質荷比為1000時分辨率可達106,分辨率與離子質量成反比,與磁場強度成正比,具有測定準確度高,掃描速度快,測定質量范圍寬等優(yōu)勢,在化合物分子量測定,結構信息獲取方面應用廣泛[5]。Orbitrap-MS采用了靜電場軌道阱作為離子的旋轉振蕩,使離子圍繞中心電極的軌道旋轉從而捕獲離子的裝置,是一種結合靜電場離子阱和快速傅里葉變換技術的新型質譜,能夠快速、可靠地篩查、識別和定量復雜基質樣品中的化合物[7],目前新型Orbitrap-MS的分辨率可達140000 FWHM,全掃描和全離子裂解(AIF）模式質量準確度均優(yōu)于1 ppm,大大提高了鑒別的可靠性,是分析實驗室進行食品安全或環(huán)境篩查、臨床研究、法醫(yī)毒物學、DMPK、代謝組學和生物制藥(完整蛋白分析）應用的理想儀器。

1.2 HRMS用于中藥代謝物鑒別的優(yōu)勢

與低分辨質譜相比,HRMS能夠提供更加精確的前體離子和碎片離子的質量,預測它們的化學元素組成,為代謝物的結構推斷提供可靠信息。HRMS與超高效液相色譜(UPLC）的完美結合是目前中藥體內代謝物鑒別的強有力手段,兼具UHPLC優(yōu)越的分離能力和質譜的高靈敏度與高專屬性。對檢測樣本處理要求低,靈敏度極高,線性范圍寬,對于樣本中濃度相差大的代謝化合物亦可達到很好的檢測效果[6],在中藥體內代謝物的鑒別過程中應用廣泛。

2 基于HRMS的中藥代謝物鑒別策略

在中藥代謝物的鑒別過程中,由于受基質中內源性物質的干擾,往往會得到數(shù)以千計的化合物,如何從這些化合物中篩選并且鑒別出代謝物是個挑戰(zhàn)。近年來,文獻中報道的一些基于HRMS的策略,能夠讓鑒別過程事半功倍。

2.1 HRMS結合多元統(tǒng)計分析的鑒別策略

多元統(tǒng)計分析一般包含無監(jiān)督的主成分分析(PCA）,有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析(PLS-DA）,正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA）,PCA能夠反映對照組和給藥組組間離散程度,PLS-DA在加入分組信息后,盡可能的減少或消除了組內差異,強化了組間差異[2]。通過OPLS-DA能夠篩選出對組間差異貢獻較大的成分,通常以S-Plots圖中變量投影重要性指標(VIP,Variable Importance in Projection）作為衡量標準,VIP值大于1,且在生物樣本成分趨勢圖中只存在于給藥組而不存在空白組的成分即為潛在的代謝物。此策略的思路和方法主要源于代謝組學,所以,也有文獻稱其為非靶標代謝組學策略[8]。

HRMS得到的原始數(shù)據(jù)首先要經過代謝組學軟件的處理,包括峰識別,峰對齊,以及與代謝物數(shù)據(jù)庫匹配等,生成包含峰編號,保留時間-質荷比以及離子強度的三維數(shù)據(jù)集,經過標準化處理后,能直接導入到多元統(tǒng)計分析軟件進行分析,篩選出中藥體內代謝物。常用的代謝組學處理軟件有XCMS online、 MetAlign、 MZmine、 MAVEN、 MetaboAnalyst, 以及一些商業(yè)化軟件 Mass Profiler Pro(Agilent）,Metabolic Profiler(Bruker）,Progenesis QI 2.0(Waters）等, 其中以 XCMS online 使用最多[9]。Simca-P、Ezinfo 3.0軟件是主要的多元統(tǒng)計分析軟件。

Xian-Na Li等[10]基于UPLC-MS結合多元統(tǒng)計分析對中藥復方制劑滋腎丸進行血清藥物化學研究,給藥組和對照組的原始數(shù)據(jù)導入到Progenesis QI 2.0軟件,生成包含每一個化合物保留時間-質荷比以及離子強度的數(shù)據(jù)集,經過標準化處理后上傳到Ezinfo 3.0軟件進行OPLS-DA處理,篩選血漿中的外源性成分。VIP大于1的成分依據(jù)準確的質量和碎片離子通過UNIFI數(shù)據(jù)庫進行匹配,總共識別出33個入血成分,包含22個原型成分和11個代謝物,為其進一步藥效物質基礎的確定奠定了基礎。Kaiwen Luo等[8]利用非靶向代謝組學的手段,對梔子厚樸湯的入血成分進行鑒別,原始數(shù)據(jù)經過XCMS處理后,導入到SIMCA-P軟件中,進行多元統(tǒng)計分析,對篩選出的外源性成分進行了鑒定,總共鑒別出35個原型成分和26個代謝物。

HRMS結合多元統(tǒng)計分析的優(yōu)勢是比較高效,能夠在大量內源性物質干擾的情況下快速篩選出外源性成分,并能通過進一步地與代謝物數(shù)據(jù)庫進行匹配,實現(xiàn)化合物的快速鑒別。另外,作為一種非靶向的鑒別策略,能夠實現(xiàn)對未知代謝物的鑒別,減少因原型成分和代謝途徑設置不全面造成的遺漏,綜合來說,比較適合中藥復雜體系體內代謝物的鑒別。

2.2 HRMS結合代謝物預測軟件的鑒別策略

基于代謝物預測軟件的鑒別策略是一種靶向的鑒別方法,最初用于單體化合物代謝物的識別和鑒定,近年來,隨著功能的優(yōu)化和完善,在中藥復雜體系中的應用也越來越多[2]。目前,很多軟件和平臺都具有代謝物預測的功能,如Metabolynx、UNIFI、Peakview等,這些軟件的使用提高了鑒別的效率。在中藥鑒別過程中一般以中藥體外成分和其入血的原型成分作為母體化合物,根據(jù)設置化合物的代謝途徑和適當?shù)倪^濾參數(shù),能夠實現(xiàn)對代謝物的有效提取和鑒別。

除了能夠通過代謝途徑預測代謝物外,質量虧損過濾(MDF）也是其重要技術手段。MDF的理論基礎是代謝物與原型成分小數(shù)部分的精確質量數(shù)變化不大,可以通過設定較窄的質量虧損范圍,對HRMS采集到的數(shù)據(jù)進行處理和識別,減少內源性物質對鑒別過程的干擾[11]。

Ran Wu等[12]基于UHPLC-Q-TOF-MS對芪精升白顆粒的體外化學成分和體內代謝物進行了研究,在代謝物的鑒別過程中主要利用了Metabolynx代謝物預測功能。首先,自建體外化合物數(shù)據(jù)庫,體外樣品和血清樣品通過UNIFI與體外數(shù)據(jù)庫匹配,完成體外成分和入血原型成分的鑒別,Metabolynx軟件能夠基于這些化合物進行代謝物的預測,然后通過UNIFI與血清樣品再一次的匹配,最后結合中性丟失,診斷離子策略,總共鑒別出了18個代謝物(鑒別過程如圖1所示）。Tao Shi等[13]利用Metabolynx軟件結合MDF技術,對參松養(yǎng)心湯的體內代謝物進行鑒別,總共鑒別出47個代謝物,I相代謝中的氫化,羥基化,去甲基化以及II相代謝中的葡萄糖醛酸化是其主要代謝途徑。

圖1 QJSB體外和體內化學成分鑒別策略Fig.1 The strategy for the identification of multiple components in vitro and in vivo of QJSB

HRMS結合代謝物預測軟件的優(yōu)勢是比較省時省力,但是也有可能造成代謝物的遺漏,中藥進入體內后,除了一些常規(guī)的代謝途徑外,可能還要經歷環(huán)氧化,過氧化以及結構重排等類型的代謝反應,造成質量發(fā)生較大的變化,代謝物預測軟件很難對這些化合物進行有效的預測[3]。

2.3 基于HRMS結合提取離子流圖（EIC）的代謝物鑒別策略

提取離子流圖(EIC）策略是靶向的代謝物鑒別策略,對于可預測或已知生物轉化反應的代謝產物適用[14]。研究者可借助SciFinder,PubMed,Web of Science,中國知網CNKI等數(shù)據(jù)庫進行文獻挖掘,建立代謝物數(shù)據(jù)庫,包括準確的分子量,前體離子以及碎片離子等信息,對于多藥材的復方制劑來說,可收集各單味藥材的代謝物信息。通過設定的質荷比范圍查找該代謝物在給藥樣品中的存在情況,然后進一步通過HRMS采集的碎片離子信息對化合物的結構進行確證。通過提取特定質荷比離子的手段,能夠消除內源性物質對鑒別過程的干擾,但是,無法發(fā)現(xiàn)新的代謝物,且鑒別過程較其他策略相比工作量較大。

2.4 多種途徑聯(lián)用的代謝物鑒別策略

中藥體內代謝物鑒別策略各有利弊,綜合使用,才能揚長避短,達到高效、準確鑒別代謝物的目標。

Nan Mi等[15]在中藥復方制劑丹梔片(DZT）大鼠體內代謝物的鑒別過程中介紹了一種基于HRMS的集成策略,綜合了多元統(tǒng)計分析和代謝物預測兩種技術手段。如圖2所示,首先,通過UPLC-Q-TOF/MS采集空白組和給藥組血漿的質譜信息,然后,對大量的原始數(shù)據(jù)進行分析,包括利用Progenesis QI2.0軟件進行峰識別、峰對齊和利用Ezinfo 3.0軟件進行偏最小二乘判別分析(OPLS-DA）,在VIP Plots圖中篩選VIP值大于1的作為潛在外源性成分。同時,利用UNIFI平臺對丹梔片體外成分和入血原型成分的代謝物進行預測,將篩選出的血漿外源性成分與預測的代謝物進行匹配。對于未能匹配的化合物通過中性丟失,診斷離子以及相關文獻的報道進一步鑒定,總共鑒別出了119個代謝物。本研究介紹的集成策略與多元統(tǒng)計分析相比,大大縮減了代謝物的鑒別過程；與單純依靠代謝物預測軟件相比,大大減少了代謝物遺漏的可能性。

圖2 DZT大鼠血漿代謝物鑒別策略Fig.2 The strategy for metabolite identification of DZT in rat plasma

3 結 語

高分辨質譜(HRMS）不僅能夠提供準確的質量數(shù),而且通過結合雜化的多功能質譜獲得多級質譜數(shù)據(jù),是代謝物鑒別策略得以使用的基礎。在數(shù)據(jù)處理過程中,多元統(tǒng)計分析、代謝物預測軟件以及提取離子色譜等策略,都具有各自的利弊,多種策略的聯(lián)合使用能提高鑒別的效率和可靠性。