胡星榮，李盛華，周明旺，肖 振，劉一飛，陳彥同，王鵬志

（1. 甘肅中醫(yī)藥大學 蘭州 730020；2. 甘肅省中醫(yī)院 蘭州 730050）

股骨頭壞死是由于股骨頭動脈缺血或中斷，導致骨細胞和骨髓成分部分死亡，從而致使股骨頭結構改變、塌陷，引發(fā)髖關節(jié)疼痛及功能障礙的一種難治性骨科疾病[1-3]。也是青年人群（33-38歲）致殘和髖關節(jié)置換的主要原因[4]。我國現(xiàn)有近700萬人罹患該病，男女比例約為2.5:1[5]。其中非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（Nontraumatic osteonecrosis of femoralhead，NONFH）居第二位，隨著對該病發(fā)病機制研究的不斷深入，出現(xiàn)了血管內凝血紊亂、脂肪栓塞、脂質代謝紊亂、細胞毒性、細胞損傷及基因多態(tài)性等多種壞死學說。但由于其發(fā)病機制較復雜，仍未能全面闡釋其發(fā)病機理，由此導致對NONFH 的保髖療法難以達到理想的效果，課題組前期研究結果顯示血瘀質為NONFH 高發(fā)體質之一[6]，同時傳統(tǒng)中醫(yī)藥防治股骨頭壞死的作用逐漸得到眾多學者的認可[3,7]，因此研究血瘀質與NONFH 間的內在關系對防治該病具有重要的臨床意義，故本研究通過分析NONFH 壞死體積百分比與血瘀質評分及血清指標的相關性，為防治NONFH提供參考。

1 臨床資料

1.1 病例診斷及納入標準

診斷及分期：參照《成人股骨頭壞死臨床診療指南(2016)》和國際骨微循環(huán)研究協(xié)會（Association Research Circulation Osseous，ARCO）分期系統(tǒng)[3,8]。

納入標準：①符合診斷標準的股骨頭壞死患者（包括接受手術或中醫(yī)藥對癥治療者）；②年齡18-60歲；③愿意接受本次科研調查研究者。排除標準：①診斷為創(chuàng)傷性股骨頭壞死的患者；②妊娠或哺乳期婦女，過敏體質者或不能接受本治療方法者；③既往無合并腫瘤心腦血管疾病或近期感染性疾病者；④近1年應用激素類或大量飲酒者；⑤近期無感染性疾病以及其他嚴重代謝異常疾病患者；⑥精神病患者、智力障礙者；⑦正在參加其他臨床試驗的患者。剔除和脫落標準：有下述任何1項者即可排除：①患者依從性差，未能按照要求填寫者。②采集項目不完整，缺項多于20%者。③體質分型判定為兼夾體質者。本研究經醫(yī)院倫理委員會討論并獲得批準，與受試者簽訂知情同意書。

1.2 建立數(shù)據(jù)庫

股骨頭壞死數(shù)據(jù)庫病例來源于甘肅省中醫(yī)院關節(jié)一、二、三科住院患者。對NONFH 患者血瘀質評定分值。（中醫(yī)體質判定及評分：參照《中醫(yī)體質分類與判定》標準制訂調查表判定中醫(yī)體質[9]）。

1.3 一般材料

按照隨機數(shù)生成器軟件產生的隨機數(shù)抽取數(shù)據(jù)庫 中 2018 年 10 月 至 2019 年 10 月 NONFH 病 例 19 例（見表1）。共34髖，左髖壞死2例，右髖壞死2例，雙髖壞死15 例。（7 例激素性NONFH 中因類風濕性關節(jié)炎激素治療 4 例，1 例男性，3 例女性，平均年齡 50±4.97歲；因腰椎間盤突出癥激素治療2 例，年齡分別為52、54 歲。2 例為酒精性股骨頭壞死患者，飲酒量均＞100 ml/天，飲酒時間均＞10 年，均為男性，年齡分別為48、50 歲。10 例為特發(fā)性股骨頭壞死患者，6 例男性，4 例女性，平均年齡50.6±4.5歲）。

2 研究方法

2.1 血清指標檢測

因NONFH 分布不集中，故指定專職調查者進行病例的收集和血清樣本采集。

患者禁食10 h 后，于入院第二天空腹采集5 ml 晨間肘正中靜脈血，置于采血管，在2 h 以內，4℃離心機1 500 r/m，離心10 min，吸取血清等量分裝于兩支1.5 ml EP 管中，貯存于-80℃冰箱中。其中一管采用人ELISA 試劑盒NO、VEGF(江蘇省酶免公司)檢測血清。另一管使用全自動生化分析儀[日立高新技術（上海）國際貿易有限公司，標準號：YZB/JAP1498-2014，型號：日立LABOSPECT 008 AS]檢測血清Hcy（酶循環(huán)法）水平。

2.2 CT重建測量股骨頭壞死體積

患者仰臥于CT 掃描床上，以飛利浦Brilliance 128排螺旋對雙側髖臼上緣3.0 cm 到大轉子頂點下15 cm范圍內沿橫斷面連續(xù)掃描。掃描條件：選擇軟組織窗（前期試驗軟組織窗較骨窗能保存更多掃描信息，三維重建后擬合度更佳），電壓120 kV，像素大小0.43 mm，層厚0.625 mm，共142層，掃描數(shù)據(jù)以Dicom3.0標準直接存入移動硬盤備用。由關節(jié)?？苾晌桓敝魅吾t(yī)師經雙盲法獨立評閱CT及X線片，結合病史和臨床表現(xiàn)診斷為NONFH。

2.2.1 建模環(huán)境

電腦配置：AMDAthlon64 3200+中央處理器、2G內存、15.6 英寸液晶顯示器、64M 顯存、ATI 8550 顯卡、Win7 操作系統(tǒng)；軟件：醫(yī)學3-D 圖像生成及編輯處理軟件Mimic17.0（Materialise公司，比利時）。

2.2.2 建立幾何模型

將DICOM 影像導入交互式醫(yī)學影像控制系統(tǒng)Mimics17.0 軟件（Materialize，Inc.，比利時）。首先經圖像定位，使用閾值分割HounsField 將骨骼和軟組織分離（見圖1）建立蒙板圖層；然后通過區(qū)域增長選取股骨頭正常區(qū)域；將該蒙板清除，保留閾值，再使用多層編輯工具從股骨頭頂層逐層選取該閾值股骨頭正常區(qū)域（見圖2）；最后，通過蒙板重建Custon 3D 計算方式建立股骨頭三維幾何模型，同樣方法對股骨頭壞死區(qū)域建模（見圖3、圖4）。

自動計算生成的壞死股骨頭的體積（V壞）和正常區(qū)域體積（V正）（見圖5），計算總體積（V總）=V正+V壞，單側NONFH 以患側的壞死率代表總壞死率，雙側NONFH 以雙側壞死率的平均值代表總壞死率（見表1）。

2.3 觀察指標

CT三維重建計算總壞死率（V/V%）（見表1），血瘀質評分值，檢測血清NO（μmold·L-1）、VEGF（pg·mL-1）、Hcy（μmold·L-1）。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 軟件分析，總壞死率以百分比（%）表示，血瘀質評分及血清NO、VEGF、Hcy以均數(shù)±標準差（）表示。對于計量資料采用Pearson 相關性分析，對于等級資料采用Spearman 相關性分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01差異有顯著統(tǒng)計學意義。

圖1 閾值分割

圖2 正常區(qū)域選擇

圖3 正常區(qū)三維建模

圖4 壞死區(qū)三維建模

圖5 壞死體積占比

3 結果

3.1 壞死率與壞死分期的一致性

總壞死率與雙側壞死分期具有明顯相關性（P＜0.01，r左=0.655；r右=0.579）（見表1）。表明應用精確總壞死率可以代表股骨頭壞死程度，以便后續(xù)統(tǒng)計分析。

3.2 總壞死率、血瘀質與各指標的相關性

總壞死率與NO、VEGF、Hcy 具有相關性，根據(jù)相關系數(shù)r 判斷，相關性依次為NO ＞ VEGF＞ Hcy；血瘀質評分與總壞死率也存在一定相關性，但相關度較?。╮=0.575）（見表2，圖6）。血瘀質與血清Hcy 密切正相關（r=0.824）（見圖7），而與NO、VEGF 未見明顯相關。

表1 股骨頭總壞死率與壞死分期相關性分析（,%）

表1 股骨頭總壞死率與壞死分期相關性分析（,%）

注：NONFH 分期與股骨頭總壞死率（V/V%）的相關性檢驗Δ P＜0.01。

P值0.002ΔΔ 0.009ΔΔ相關系數(shù)r 0.655 0.579部位左側壞死率右側壞死率總壞死率例數(shù)17 17 19壞死率（V/V%）29.61±13.12 35.75±17.40 36.40±9.76

圖6 壞死率與各指標的相關性比較

表2 總壞死率與各血清指標和血瘀質評分相關性檢驗（）

表2 總壞死率與各血清指標和血瘀質評分相關性檢驗（）

注：與股骨頭總壞死率（V/V%）的相關性 ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與血瘀質的相關性 *P＜0.01。

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圖7 血瘀質與Hcy相關性

4 討論

NONFH 屬于中醫(yī)“骨蝕”、“骨痹”等病癥范疇，因其發(fā)病隱匿，現(xiàn)對保髖治療仍無統(tǒng)一標準，因此對該病的預防尤為重要。而中醫(yī)藥防治NONFH 已被廣大學者所接受，通過對高危體質人群進行調體干預，可有效預防NONFH發(fā)生。

近年來學者對NONFH 的中醫(yī)體質與基因多態(tài)性關系的研究較為關注，兩者對疾病的易感性方面具有相似的理論和研究證據(jù)[9-11]。中醫(yī)體質學說源于《靈樞·陰陽二十五人》，是指人體相對穩(wěn)定的固有特質，也是人在生長、發(fā)育過程中與外環(huán)境相適應的個性特征。它與人們的生活習慣、飲食結構差異有較大關系。NO 在體內分布較為廣泛，具有舒張血管平滑肌的作用[12]，它與中醫(yī)體質間存在一定的相關性[13]。研究[10,14]證實：內皮型一氧化氮合成酶（eNOS）的基因多態(tài)性攜帶rs1799983 的t 等位基因顯著降低了NONFH 發(fā)病風險；而eNOS 的4b/a 多態(tài)性的等位基因a 與特發(fā)性和繼發(fā)性股骨頭壞死之間也存在顯著相關性。VEGF 可促進血管內皮細胞增殖，增加血管通透性。Hong 等[15]進行了一項 Meta 分析顯示：VEGF 基因的634G/C 多態(tài)性與股骨頭壞死的發(fā)病具有顯著關聯(lián)性。Zhou 等[11]對 1 025 例股骨頭壞死患者和 1 730 例健康人群進行了基于NO 和VEGF 2 個基因的多態(tài)性Meta 分析，結果顯示：具有 VEGF rs2010963 G＞C 和eNOS rs2070744 T＞C 基因的患者更易罹患股骨頭壞死。由此可見NO 和VEGF 與股骨頭壞死的發(fā)病具有密切關系。

Hcy為蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中產生的重要中間產物，其濃度維持在較低水平。研究[16]表明：葉酸和VitB12 共同參Hcy 的代謝，大量飲酒或飲食中缺乏葉酸和VitB12 均可致血清Hcy 明顯升高。高濃度的Hcy 可使NO 失活，造成血管平滑肌舒張功能減退，導致血管功能障礙[17-18]；同時Hcy 可導致活性氧簇（Eactive oxygen species，ROS）產生的時間依賴性增加，誘導VEGF-VEGFR2-FAK 信號軸激活，使內皮功能修復出現(xiàn)障礙[18]，最終導致股骨頭血供中斷而壞死。 而Hcy 是由亞甲基四氫葉酸還原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因來調控，多項研究[19-20]證實：MTHFR基因C677T位點的多態(tài)性與股骨頭壞死關系十分緊密。

本研究發(fā)現(xiàn)，NONFH 患者的血清Hcy與血瘀質評分呈較強正相關，結合本課題組前期研究結果：血瘀質為 NONFH 的高發(fā)體質之一[6]，提示：NONFH 的發(fā)生與Hcy 升高有較大關系，Hcy 升高可能是導致血瘀體質的重要原因之一。但此次研究中血瘀質評分和Hcy水平對NONFH壞死率的相關性均較低，推測Hcy增高可能僅是NONFH 的誘因，對NONFH 的進展速度關系較小。

VEGF 在股骨頭壞死區(qū)域單位體積內含量降低[21]，但本研究表明：血清VEGF 水平隨壞死率的增加升高，提示可能股骨頭內血管受損總量隨壞死體積的增加而增加，出現(xiàn)血清VEGF升高。而NO是否也存在與VEGF相同的機制仍需進一步深入研究。

由此推測，血瘀質NONFH 患者因個人生活和飲食習慣以及自身遺傳等影響，可能通過MTHFR 基因調控后血清Hcy 的濃度較其他體質人群更高，激活了ROS-VEGF-VEGFR2-FAK 信號軸，使股骨頭局部單位體積內NO、VEGF 水平降低，加劇股骨頭血流中斷，故較其他體質更易發(fā)生股骨頭壞死。

本試驗通過CT 三維重建計算壞死體積率較ARCO 等級分期能更精確表達壞死嚴重程度；對于血瘀體質根據(jù)評分進行分析較二分類變量更易體現(xiàn)體質的漸變性和兼夾體質。但因NONFH 發(fā)病隱匿未收集到早期NONFH病例，結果可能存在偏倚。

綜上所述，盡管基因多態(tài)性可以預測患病的易感性，但基因調控蛋白的合成兩者不在同一層面，具有復雜性，存在多個基因或一個基因的多個位點同時調控一個蛋白，多種蛋白參與股骨頭壞死的發(fā)病，其研究結果對篩查易感人群仍有局限性。

與此相反，中藥對機體功能狀態(tài)的調整與調節(jié)基因表達和對表達的修飾有關，且中藥可通過多基因、多靶點改變蛋白性狀和功能。益氣活血類中藥如黃芪、當歸為補氣血、活血化瘀常用藥對，它能夠通過調節(jié)細胞增殖相關基因cyclin D、c-fos、c-myc 和PCNA，以及細胞外基質代謝相關基因MMP-2、MMP-9、OPN 和凋亡基因Bcl-2、caspase-3、VEGF 等的表達，從而發(fā)揮調節(jié)血管平滑肌細胞表型和抑制其增殖的作用，具有擴張血管和抗凝血功能[22-23]。對NONFH 的高危體質人群在進行激素治療，或長期飲酒之人予以益氣、活血化瘀中藥或食材，可預防該病的發(fā)生，但仍需進一步研究。

隨著循證醫(yī)學對中藥治療股骨頭壞死臨床療效的再評價和再認識，中醫(yī)藥治療NONFH 的療效已得到普遍認可[6,24-25]。在理論方面也有所發(fā)展，提出了：從瘀、痰、濕、毒等論治股骨頭壞死[26-29]。預期隨著理論深入、規(guī)范、科學的研究和臨床驗證，中醫(yī)藥防治股骨頭壞死不僅可以改善患者的生活質量，還能減輕經濟負擔。