李 諾，李依聰，張 瑋，衛(wèi)博文，蘇澤琦，丁 霞，李 ?。?/p>

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室 北京 102488；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東直門醫(yī)院 北京100700；3. 北京中醫(yī)藥研究院 北京 100029）

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是以胃黏膜腺體萎縮、減少為主要特征的消化性疾病，如果得不到及時(shí)有效治療，可發(fā)展為胃癌前病變（precancerous lesions of gastric cancer，PLGC）進(jìn)而轉(zhuǎn)變成胃癌（gastric carcinoma，GC）[1]。早期胃癌的臨床隱匿性較高，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，治療和預(yù)后均不理想。因此，在慢性萎縮性胃炎階段積，極有效的干預(yù)治療成為防治胃癌前病變及胃癌發(fā)生、降低胃癌死亡率的重要措施[2]。

中醫(yī)學(xué)無CAG 的名詞，可歸屬為“胃痞”“胃脘痛”“反酸”“嘈雜”等范疇，其病因復(fù)雜多樣，通常與外感六淫邪氣、飲食內(nèi)傷、情志失調(diào)、勞逸過度、素體脾胃虛弱等單一或者綜合因素有關(guān)。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，脾虛證是CAG 最常見的證候類型，且貫穿整個(gè)病程[3]。以健脾為主的中醫(yī)治法及方劑對CAG 的治療有確切的臨床療效[4]，其作用機(jī)制亟待揭示。然而，因?yàn)槿鄙俜€(wěn)定可靠的脾虛CAG 病證結(jié)合動物模型，與之相關(guān)的中醫(yī)基礎(chǔ)理論內(nèi)涵、方劑作用原理等研究很難深入。

通常意義上的實(shí)驗(yàn)動物模型是指疾病分類指導(dǎo)下的單純疾病模型，缺少中醫(yī)證候因素，很難照搬使用到中醫(yī)藥作用機(jī)制的研究中。因此，病證結(jié)合動物模型的研制成為新醫(yī)學(xué)時(shí)代科學(xué)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本課題組在已有文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建了CAG“四因素”綜合造模法，即N-甲基-N-硝基-亞硝基胍（MNNG）為主、疊加雷尼替丁、水楊酸鈉、饑飽失常四個(gè)因素，成功制備了CAG 病證結(jié)合動物模型[5-6]。該方法不僅縮短了造模時(shí)間，而且提高了模型復(fù)制的成功率。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“脾”是臟象學(xué)說中的重要組成部分,是脾胃學(xué)說的核心[7]。探討“脾”的本質(zhì)，己成為繼承和發(fā)展祖國醫(yī)學(xué)的重要課題?！捌ⅰ蹦藲庋?，后天之本，脾虛則運(yùn)化不利，水谷精微輸布失常。同時(shí)，脾與五臟六腑在功能上相互影響，《脾胃論》曰：“元?dú)庵渥?，皆由脾胃之氣無所傷，而后能滋養(yǎng)元?dú)猓蝗粑笟庵救?，飲食自倍，則脾胃之氣既傷，而元?dú)庖嗖荒艹?，而諸病之由生也”，這說明脾病會引起很多臟器系統(tǒng)的病變。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“脾”不僅與食物的消化、吸收和轉(zhuǎn)輸精微（谷精）有關(guān)，還涉及消化、內(nèi)分泌、免疫、代謝等多系統(tǒng)和臟器，尤其與消化系統(tǒng)功能和能量代謝密切相關(guān)。肝臟作為人體最大的實(shí)質(zhì)器官，參與食物消化吸收，糖、脂代謝等過程。脾虛時(shí)，肝臟出現(xiàn)一系列病理和功能改變，有研究表明[8]，脾虛時(shí)肝臟蛋白激酶C（PKC）活性明顯升高，從而促進(jìn)糖原代謝；脾虛大鼠肝組織線粒體功能、結(jié)構(gòu)、數(shù)量等改變，導(dǎo)致能量代謝障礙[9-10]。

在前期工作的基礎(chǔ)上，本研究擬探討CAG 病證結(jié)合模型大鼠肝臟功能及組織病理學(xué)的變化特征，為CAG 的本質(zhì)以及脾虛與肝臟之間關(guān)系的研究提供實(shí)驗(yàn)資料和新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

Wistar 大鼠，雄性，30 只，體重（80±10）g，購自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2014-0010，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（SPF級）。動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審批通過。

1.2 試劑與耗材

N-甲基-N-硝基-亞硝基胍（MNNG），購于梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司（貨號M0527），水楊酸鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號30169317），鹽酸雷尼替丁膠囊（石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號：331131001）。電鏡樣品制備及石蠟切片、過碘酸-Schiff試劑、硝基藍(lán)四氮唑、HE染色相關(guān)試劑和耗材均購自北京益利精細(xì)化學(xué)品公司。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所（貨號：C00921和C001021）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CAG病證結(jié)合大鼠模型制備及評估

CAG 病證結(jié)合大鼠模型制備按照本課題組已有方法[5-6]，簡要敘述如下：Wistar 大鼠 30 只，隨機(jī)分為 2組（正常對照組10 只，模型組20 只）。采用以MNNG為主的“四因素”綜合造模方法處理模型組大鼠。在造模28周時(shí)，采用中醫(yī)診斷學(xué)的方法記錄大鼠的行為學(xué)和形態(tài)特征（量表見附件）。以大鼠出現(xiàn)懶動、食少、形體消瘦、大便濕潤或者稀溏、爪色淡白少光澤不潤的程度評分。進(jìn)而從中抽取10只大鼠，取胃和肝組織行相關(guān)指標(biāo)的檢測。40周時(shí)停止造模，重復(fù)上述工作。表征比率為陽性表征數(shù)與總數(shù)之比。

2.2 血清ALT和AST水平檢測

造模28 周和40 周時(shí)，將待觀察和取材的動物禁食24 小時(shí)（自由飲水）。2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉后，經(jīng)腹主動脈取全血，靜置30 min后，離心獲取血清（3000 r·min-1，10 min），用全自動生化儀檢測血清中ALT、AST含量。

2.3 胃和肝組織病理學(xué)檢測

切取大鼠胃體和肝大葉組織，一部分行常規(guī)石蠟包埋、切片、HE 染色；另一部分肝組織，行常規(guī)冰凍切片、組化顯色。其中，過碘酸-Schiff試劑（PAS）顯示肝細(xì)胞內(nèi)糖原的分布，硝基藍(lán)四氮唑（NBT）顯示肝細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶（SDH）的分布。組織病理切片用光鏡觀察、攝片。

2.4 肝組織超薄切片透射電鏡觀察

切取1 mm×1 mm×2 mm 肝組織，經(jīng)預(yù)冷的2.5%戊二醛固定12 h，1%鋨酸雙重固定2～3 h 后，行常規(guī)脫水、Epon812環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片、醋酸鈾-檸檬酸鉛電子染色、透射電鏡觀察、攝片。

2.5 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并用Graphpad Prism5.0 軟件作圖。所有計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，資料分析前進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析（One-Way-ANOVA），如果方差齊，則用LSD 法和Dunnett 進(jìn)行分析；若方差不齊，則用Tamhane′s T2進(jìn)行分析。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)以率表示，組間比較用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 CAG病證結(jié)合大鼠模型評估結(jié)果

造模20周大鼠胃組織病理學(xué)檢測結(jié)果表明，胃黏膜層腺體數(shù)量減少、胃壁固有層變薄、未見腸化和異型增生改變，研究結(jié)果提示：造模20 周大鼠處于慢性萎縮性胃炎病理階段，與課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。造模32周時(shí)模型組大鼠胃壁顯著變薄，胃腺數(shù)量顯著減少，伴有明顯的腸上皮化生和異形增生病變，提示：造模32 周大鼠呈胃癌前病變病理階段（結(jié)果未展示，見本課題組發(fā)表論文[11]）。

脾虛證測評結(jié)果（見表1）可知：造模28 周大鼠偏嗜睡懶動、眼睛暗紅、毛干枯晦暗、爪淡白、唇淡白、舌紫黯、舌少澤不潤，大便不成形，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可評估為脾氣虛證；而造模40周大鼠偏嗜睡懶動、耳朵暗紅、眼睛暗紅、毛干枯晦暗、爪青紫、尾巴黃有瘀點(diǎn)、唇青紫、舌紫黯、舌少澤不潤、大便不成形的證候，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），特點(diǎn)以脾虛為主，兼有血瘀。

3.2 大鼠血清ALT、AST含量檢測結(jié)果

與正常組比較，造模28 周時(shí)大鼠血清ALT 和AST水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與造模28 周比較，造模40 周大鼠血清ALT 水平仍顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而AST水平?jīng)]有顯著改變，如圖1。

3.3 大鼠肝組織病理學(xué)檢測結(jié)果

肝組織石蠟切片、HE 染色結(jié)果表明，正常大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索呈放射狀排列整齊，肝細(xì)胞形態(tài)正常，見圖2A；造模28 周時(shí)，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹，如圖2B；造模40 周時(shí)，肝細(xì)胞萎縮，肝血竇變小，炎性細(xì)胞數(shù)量增多，見圖2C。肝組織冰凍切片過碘酸-Schiff 顯色，肝糖原呈紅紫色。染色結(jié)果表明，正常大鼠肝細(xì)胞糖原分布均勻，見圖2a；造模28周時(shí)，肝組織呈現(xiàn)斑狀糖原缺失區(qū)，見圖2b；造模40 周時(shí)，肝組織糖原缺失區(qū)顯著擴(kuò)大，見圖2c。肝組織冰凍切片NBT 顯色，琥珀酸脫氫酶呈藍(lán)紫色顆粒。染色結(jié)果表明，正常大鼠肝組織著色均勻、染色深，見圖2i；造模28 周時(shí)，肝小葉中央靜脈周圍細(xì)胞著色變淺，提示琥珀酸脫氫酶含量減少，見圖2ii；造模40 周時(shí)，肝組織整體著色淺，中央靜脈周圍顏色更加淺淡，提示琥珀酸脫氫酶含量顯著減少，見圖2iii。

表1 脾虛CAG模型大鼠證候量化表征比率統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n=10)

圖1 大鼠血清ALT和AST水平檢測結(jié)果(,n=10)

3.4 大鼠肝組織超薄切片透射電鏡觀測結(jié)果

透射電鏡觀察，正常組大鼠肝細(xì)胞電子染色均勻，細(xì)胞核大而圓、核膜完整，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和糖原顆粒，見圖3A。造模28 周時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹、變形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，糖原顆粒減少，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡樣改變，見圖3B；造模40 周時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹、膨大、數(shù)量顯著減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顯著減少，糖原顆粒數(shù)量顯著減少，見圖3C。

圖2 大鼠肝組織病理改變光鏡觀察結(jié)果（×400，標(biāo)尺示100 μm）

圖3 肝組織透射電鏡觀察結(jié)果（×10000）

4 討論

CAG 病因復(fù)雜、臨床癥狀無特異性，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對CAG尚無療效肯定的治療方案[12]。中醫(yī)學(xué)基于辨證論治、病證結(jié)合理論，對CAG 有理想的療效，不僅緩解臨床癥狀，而且顯著改善病變程度和進(jìn)展。通過臨床觀察及查找相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，慢性萎縮性胃炎根據(jù)臟腑辨證方法辨出的證型當(dāng)中屬脾胃虛弱型最多見。丁成華等[13]以中醫(yī)理論為基本點(diǎn)，將文獻(xiàn)研究與數(shù)據(jù)挖掘相結(jié)合，對2000-2010 年間發(fā)表在中國知網(wǎng)和維普中文期刊數(shù)據(jù)庫的文獻(xiàn)整理篩選，從中選出符合標(biāo)準(zhǔn)的7317 例病例進(jìn)行回顧性研究分析，初步了解證候分布情況，方法上以中醫(yī)藥為主診治慢性萎縮性胃炎的文獻(xiàn)進(jìn)行整理，總結(jié)證候出現(xiàn)頻率大小依次為：脾胃虛弱證＞肝胃不和證＞脾胃濕熱證＞胃陰不足證＞胃絡(luò)瘀血證，其中脾胃虛弱證出現(xiàn)頻率最高，占36.27%，說明脾胃虛損是最主要的病機(jī)。鄭保平[14]認(rèn)為，“脾胃虛弱”為慢性萎縮性胃炎（CAG）及其癌前病變的發(fā)病之本，基本證型有脾胃氣虛、脾胃虛寒、脾胃陰虛；“邪踞胃脘、久釀成毒”是CAG 及其癌前病變發(fā)展、演變的病理基礎(chǔ)和關(guān)鍵因素，常見證型有濕熱中阻、痰濕困脾、氣滯血瘀；“脾（胃）肝同病”是CAG 及其癌前病變必然的病機(jī)特征；“脾虛及腎”是CAG 及其癌前病變病機(jī)演變的轉(zhuǎn)歸，有脾腎陽虛、肝腎陰虧兩型；“脾虛絡(luò)阻、虛實(shí)夾雜”是貫穿CAG 及其癌前病變始終的基本病機(jī)。宗湘裕等[15]將CAG 辨證分為脾胃虛弱證、脾胃濕熱證、肝胃不和證、胃陰不足證、胃絡(luò)瘀血證。脾胃虛弱證偏多而胃絡(luò)瘀血證偏少可能與CAG 發(fā)展階段有關(guān)。

然而，因缺少穩(wěn)定可靠的中醫(yī)CAG 病證結(jié)合動物模型，中醫(yī)藥治療CAG 的作用機(jī)制尚不明確。脾虛證動物模型是最早被研究的中醫(yī)證候模型之一。研究者采用苦寒泄下、耗氣破血、勞倦過度、限量營養(yǎng)、藥物處理（利血平、硝酸鈷、水楊酸鈉）等方法成功的制備了脾虛證實(shí)驗(yàn)動物模型[16-19]。在臨床實(shí)踐中，“病、證、癥”三者相互依存、同步演化，割裂“病、證、癥”之間聯(lián)系的動物模型顯然不能滿足中醫(yī)理論內(nèi)涵及方劑作用原理等研究的需要。

本課題組采用MNNG 為主的“四因素”綜合造模法，通過改進(jìn)造模因素之間組合方式，縮短造模時(shí)間的同時(shí)也提高了模型成功率。然而，CAG 大鼠肝功能及組織病理學(xué)的變化尚未受研究者關(guān)注，相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究仍是空白。本課題探討了造模28 周、40 周CAG 病證結(jié)合模型大鼠肝功能及肝組織病理學(xué)的變化規(guī)律，研究結(jié)果顯示：CAG 大鼠肝功能受到一定影響，肝糖原合成和儲備能力下降，肝細(xì)胞線粒體腫脹、變性、氧化磷酸化作用受到影響。從文獻(xiàn)中得知，脾虛證大鼠肝糖原明顯低于正常大鼠[20]，葡萄糖激酶（CK）mRNA表達(dá)水平下降，CK 活性下降,導(dǎo)致肝糖原合成減弱,分解加速,糖異生增強(qiáng),并減少了肝臟和其他外周組織對葡萄糖的攝取和利用,從而使肝葡萄糖輸出增加[21]；SDH 是糖有氧氧化的關(guān)鍵酶,位于線粒體內(nèi)膜上的一種膜結(jié)合酶，是鏈接電子呼吸傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一。實(shí)驗(yàn)性脾虛證大鼠肝組織SDH 含量降低，氧化磷酸化效率下降，可能和線粒體結(jié)構(gòu)、功能破壞密切相關(guān)[22]。上述形態(tài)變化直接影響肝臟物質(zhì)代謝和能量代謝的平衡，影響機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)的輸布和能量的供給，誘發(fā)機(jī)體一系列生理、生化功能失衡，能部分解釋中醫(yī)脾虛證的臨床表現(xiàn)。

脾虛證實(shí)質(zhì)的研究一直是熱點(diǎn)研究領(lǐng)域，各種學(xué)術(shù)觀點(diǎn)碰撞、交匯，至今仍是一片迷惘。已有的研究并未局限于脾與消化系統(tǒng)的關(guān)系，涉及免疫、內(nèi)分泌、線粒體、人體正常菌群等各個(gè)方面，使得中醫(yī)脾的概念更泛化和復(fù)雜[23-25]。從另外角度，本研究證實(shí)，脾虛影響肝臟物質(zhì)代謝功能，為中醫(yī)臨床從脾論治相關(guān)疾病提供了實(shí)驗(yàn)資料。從這個(gè)意義上，基于病證結(jié)合動物模型，研究者能更好的探究脾虛證的“物質(zhì)—能量—信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”規(guī)律，有助于研究中醫(yī)脾實(shí)質(zhì)及健脾方劑的作用原理。