傅夢(mèng)薇，劉詠梅，陳恒文，周思遠(yuǎn)，劉蘭椿，李洪崢，何浩強(qiáng)，王 階＊＊

（1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院 北京 100053；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 北京 100029）

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦侵腹跔顒?dòng)脈粥樣硬化使管腔狹窄或阻塞導(dǎo)致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病，目前已成為全球亟待解決的重大衛(wèi)生問(wèn)題，屬中醫(yī)“胸痹心痛”范疇[1]。病證結(jié)合是中西醫(yī)結(jié)合臨床的重要研究方法，自20 世紀(jì)70年代以來(lái)，我國(guó)開(kāi)展了冠心病的中醫(yī)證候研究，確立了證候診斷標(biāo)準(zhǔn)，為后續(xù)的中藥臨床藥效研究及新藥試驗(yàn)提供了支撐。陳可冀院士認(rèn)為血瘀是冠心病的主要病機(jī)，并提出運(yùn)用中醫(yī)藥活血化瘀治法治療冠心病[2]。冠脈造影或冠狀動(dòng)脈血管成像等檢查手段證實(shí)冠心病患者均存在冠狀動(dòng)脈狹窄，根據(jù)中醫(yī)證候積分可發(fā)現(xiàn)均符合血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)，故普遍認(rèn)為血瘀證是冠狀動(dòng)脈狹窄的病理基礎(chǔ)[3]。近年來(lái)，眾多學(xué)者聚焦于冠心病血瘀證的證候客觀化臨床研究[4]，尤其是微觀層面的基因組學(xué)與證候之間的關(guān)聯(lián)，極大地推進(jìn)了證候的客觀化研究，如圍繞miRNA 進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究就被認(rèn)為是21 世紀(jì)生物學(xué)領(lǐng)域的重大進(jìn)展。與基因組學(xué)研究相比，蛋白質(zhì)組學(xué)研究主體為生物大分子并作為疾病診斷標(biāo)記物，而非DNA和RNA。目前心血管領(lǐng)域?qū)谛牟⊙鲎C蛋白組學(xué)的研究仍處于起步階段，多著眼于鑒定其蛋白組學(xué)特點(diǎn)、中醫(yī)藥干預(yù)的療效監(jiān)測(cè)等，研究方法多種多樣，主要有：①冠心病血瘀證患者與健康人對(duì)照；②冠心病血瘀證與非血瘀證患者對(duì)照；③冠心病血瘀證、非血瘀證患者與健康人三者對(duì)照。由于研究方法存在差異，研究者對(duì)冠心病血瘀證存在的相關(guān)蛋白與涉及的病理過(guò)程等方面仍存在爭(zhēng)議。為此，本研究對(duì)冠心病血瘀證蛋白組學(xué)研究方法及其結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，以期為未來(lái)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索策略

計(jì)算機(jī)檢索中國(guó)知識(shí)資源總庫(kù)（CNKI）、中國(guó)學(xué)術(shù)期刊數(shù)據(jù)庫(kù)（Wanfang Data）、Cochrane、Medline。檢索范圍均為建庫(kù)-2020年2月公開(kāi)發(fā)表的與冠心病血瘀證蛋白組學(xué)相關(guān)的臨床試驗(yàn)或基礎(chǔ)研究。采用專業(yè)檢索，根據(jù)不同數(shù)據(jù)庫(kù)制定具體檢索式（詳見(jiàn)附錄）。中文檢索詞：冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、冠心病、血瘀、心脈瘀阻、胸痹、蛋白；英文檢索詞：Coronary artery disease，Coronary atherosclerosis disease，Blood Stasis，Proteomics。

1.2 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)

①文章類型：采用隨機(jī)對(duì)照設(shè)計(jì)的中英文研究，無(wú)論是否采用盲法或分配隱藏；②受試者：滿足2016年中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)制定的《冠心病血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)》的患者，年齡構(gòu)成、性別比例、病程不限；③主要結(jié)局：差異蛋白質(zhì)的種類及表達(dá)水平。

1.3 文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)

①綜述或述評(píng)；②動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；③重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)；④血瘀證合并其他證候；⑤未采取蛋白組學(xué)方法；⑥會(huì)議論文。

1.4 文獻(xiàn)納入篩選

將數(shù)據(jù)導(dǎo)入NoteExpress3.2.0 進(jìn)行查重管理。閱讀文章標(biāo)題和摘要，剔除主題不相關(guān)文獻(xiàn)，然后下載并閱讀全文，嚴(yán)格根據(jù)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步篩選。

1.5 資料提取

由2名評(píng)價(jià)員（傅夢(mèng)薇、周思遠(yuǎn)）獨(dú)立按照事先設(shè)計(jì)的表格提取符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)資料，當(dāng)意見(jiàn)不一致時(shí)通過(guò)討論協(xié)商或向第3位研究員（劉蘭椿）咨詢解決。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索及篩選結(jié)果

初步檢索獲得文獻(xiàn)259 篇，其中包括中國(guó)知網(wǎng)的140 篇、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)的91 篇、Medline 數(shù)據(jù)庫(kù)的12 篇、Cochrane數(shù)據(jù)庫(kù)的16篇，利用NoteExpress 查重剔除重復(fù)33 篇，剩余文獻(xiàn)226 篇。對(duì)剩余文獻(xiàn)閱讀文題和摘要初篩，刪除111 篇與研究?jī)?nèi)容不符的文獻(xiàn)，剩余115篇文獻(xiàn)進(jìn)行閱讀全文復(fù)篩。全文復(fù)篩后排除101篇文獻(xiàn)，其中綜述或述評(píng)13 篇、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)9 篇、臨床資料重復(fù)15 篇、合并其他證候35 篇、未采取蛋白組學(xué)技術(shù)25篇、會(huì)議論文4 篇，最終納入定性分析的文獻(xiàn)數(shù)為14篇，均為原始研究（圖1）。

2.2 文獻(xiàn)基本特征

根據(jù)納入研究的16篇文獻(xiàn)顯示，目前尋找差異蛋白的冠心病血瘀證蛋白組學(xué)研究方法有以下3種：①將冠心病血瘀證患者與健康人進(jìn)行對(duì)照；②將冠心病血瘀證患者與冠心病非血瘀證患者進(jìn)行對(duì)照；③將冠心病血瘀證患者、冠心病非血瘀證患者、健康人三者進(jìn)行對(duì)照。從樣本大小、檢測(cè)內(nèi)容、技術(shù)手段、差異蛋白質(zhì)點(diǎn)及表達(dá)水平、差異蛋白質(zhì)介導(dǎo)的生物學(xué)過(guò)程等進(jìn)行信息提取與分析（表1）。

表1 納入蛋白組學(xué)研究的文獻(xiàn)基本特征

續(xù)表1

圖1 文獻(xiàn)檢索流程圖

2.3 涉及病理機(jī)制

從納入文獻(xiàn)的蛋白組學(xué)研究結(jié)果來(lái)看，冠心病血瘀證可能涉及炎癥反應(yīng)、凝血系統(tǒng)異常與脂代謝紊亂等病理機(jī)制（表2）。

表2 涉及病理機(jī)制代謝途徑的主要差異蛋白種類及表達(dá)水平

2.3.1 炎癥反應(yīng)

hs-CRP、Haptoglobin、α1-Antitrypsin、Fibrinogen、Vitamin D-Binding Protein 與sICAM-1 是冠心病血瘀證最關(guān)鍵的表達(dá)水平升高的6種差異蛋白（圖2）。

hs-CRP 是反映炎癥的重要指標(biāo)，可上調(diào)粘附因子表達(dá)并促進(jìn)炎癥因子分泌，黏附因子sICAM-1 的表達(dá)水平可反映粥樣斑塊的局部量；炎癥因子通過(guò)細(xì)胞因子作用損傷血管內(nèi)皮，使NO 失活分解并釋放大量的自由基，進(jìn)一步損傷內(nèi)皮細(xì)胞，引起血管痙攣、脂質(zhì)代謝失常。此外，CRP 的升高促進(jìn)可巨噬細(xì)胞攝取LDL，將其轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，可同樣增加粥樣斑塊。以上過(guò)程共同促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成，最終造成心肌缺血、缺氧，心肌細(xì)胞損傷，引發(fā)冠心病的產(chǎn)生。因此，CRP 與sICAM-1 聯(lián)合在增加淋巴細(xì)胞遷移至病灶的過(guò)程中發(fā)揮作用，是與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、演變和進(jìn)展重要的促炎因子[19-21]。Haptoglobin 作為一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，具有抗氧化、抗菌等作用，表達(dá)水平與炎癥反應(yīng)呈正相關(guān)[22]。α1-Antitrypsin 與Fibrinogen 也是急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，具有抗炎、抗凋亡的機(jī)體保護(hù)作用，兩者表達(dá)量的升高說(shuō)明炎癥反應(yīng)的發(fā)生。Vitamin D Binding Protein 是肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，可結(jié)合Vitamin D 和肌動(dòng)蛋白，在炎癥反應(yīng)中起到一定作用[23]。Transthyretin 含量與炎癥反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)，可能是機(jī)體代謝失常的潛在標(biāo)志物[24]。這些與炎癥相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平差異反映出冠心病血瘀證存在炎癥反應(yīng)。

2.3.2 凝血系統(tǒng)異常

現(xiàn)代研究認(rèn)為，血瘀證證候的形成可能與凝血-纖溶系統(tǒng)異常導(dǎo)致的血液高凝狀態(tài)、血栓形成等密切相關(guān)，故在冠心病血瘀證的蛋白組學(xué)研究中，凝血-纖溶系統(tǒng)相關(guān)蛋白是比較重要的研究方向[25-26]。血小板微粒PMPs、血小板表面膜糖蛋白CD62p、血小板激活復(fù)合物PAC-1、白細(xì)胞分化抗原CD40L、CD41、GMP-140、Actinγ、PAI-1、t-PA 等是冠心病血瘀證與凝血過(guò)程關(guān)系密切的主要差異蛋白（圖3）。

圖2 炎癥反應(yīng)差異蛋白作用途徑

圖3 凝血-纖溶系統(tǒng)差異蛋白作用途徑

PMPs 具有黏附、聚集血小板及促炎癥反應(yīng)的作用；PMPs 表達(dá)CD62p 后可使血小板活化，從而形成血栓，研究表明CD62p 濃度與血瘀證積分呈顯著正相關(guān)[27]；PAC-1 與Fg 結(jié)合后協(xié)助血小板聚集，進(jìn)一步促進(jìn)凝血過(guò)程；CD40L 主要作用是促進(jìn)白細(xì)胞聚集，還可結(jié)合其受體CD40 從而激活血小板，進(jìn)而推動(dòng)促凝血過(guò)程；CD41和β3以結(jié)合后形成αⅡb-Ⅲa，是血小板最重要的膜受體，故CD41 表達(dá)水平可反映出血小板聚集程度；GMP-140 在血小板活化時(shí)從α顆粒轉(zhuǎn)移到膜上，標(biāo)志著血小板活化，故在血栓性疾病發(fā)病過(guò)程中顯著升高；Actinγ是血小板骨架蛋白的組成部分，有推測(cè)認(rèn)為其在冠心病血瘀證患者血液中上調(diào)是為了在血小板完全活化前為后續(xù)血小板分泌、變形、移動(dòng)做準(zhǔn)備；PAI-1 是PA 的主要生理抑制物，能滅活t-PA活性，阻斷纖溶酶原激活，從而促進(jìn)凝血。以上8種差異蛋白均與血小板參與凝血反應(yīng)呈正相關(guān)，可通過(guò)影響血小板形態(tài)變化、血小板間、血管內(nèi)皮細(xì)胞與血小板的粘附遷移來(lái)起到促凝血作用，其表達(dá)水平的上調(diào)標(biāo)志著凝血過(guò)程處在亢進(jìn)階段。而t-PA 作為纖溶系統(tǒng)標(biāo)志物，可反應(yīng)血液中纖溶活性大小，纖溶系統(tǒng)可防止體內(nèi)血栓形成，與凝血系統(tǒng)處在平衡狀態(tài)已維持機(jī)體正常狀態(tài)，故t-PA的表達(dá)水平與凝血活性呈負(fù)相關(guān)。在冠心病血瘀證患者血液中出現(xiàn)明顯的t-PA 表達(dá)下調(diào)，代表其纖溶活性下降，凝血活性增加，從而促進(jìn)血管內(nèi)凝血和血栓形成。

2.3.3 脂代謝紊亂

在納入的14項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)與脂代謝相關(guān)的差異蛋 白 主 要 有ApoA-I、ApoA-IV、ApoJ（Clusterin）與APO-B1004種（圖4）。

ApoA-I 是HDL 的主要成分，其表達(dá)水平可代表HDL 的含量；ApoA-IV 可介導(dǎo)肝細(xì)胞結(jié)合HDL，利于膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)外排；ApoJ（Clusterin）存在于HDL 和VHDL 中，同樣可促進(jìn)膽固醇外流，協(xié)同HDL 起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。APO-B1005具有維持LDL 結(jié)構(gòu)、識(shí)別LDL 受體和正向轉(zhuǎn)運(yùn)Cho l等作用，故其表達(dá)水平與LDL呈正相關(guān)。故ApoA-I、ApoA-IV、ApoJ 的表達(dá)水平與冠心病血瘀證嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，APO-B1005 表達(dá)水平與其呈正相關(guān)。此外，臨床常用APOA1/APOB100 作為冠心病防御因子（HDL）/危險(xiǎn)因子（LDL）之比，比單獨(dú)測(cè)定APOA1 和APOB100 更有意義，當(dāng)其比值＜1 時(shí)可認(rèn)為是冠心病的危險(xiǎn)指標(biāo)[28]。冠心病血瘀證患者的前三項(xiàng)差異蛋白表達(dá)水平均比健康人降低，且APOA1/APOB100比值也已下降至＜1的水平，可見(jiàn)冠心病血瘀證存在脂代謝紊亂，這可能與冠心病動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程相關(guān)，與血瘀證的證候特異性還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

圖4 脂代謝過(guò)程差異蛋白作用途徑

2.3.4 其他生物學(xué)過(guò)程

除上述差異蛋白外，在冠心病血瘀證中上調(diào)的其他蛋白還有Serum albumin、Retinol-blinding protein4等。Serum albumin 在人體內(nèi)血液內(nèi)含量豐富，參與多種代謝過(guò)程，心肌缺血發(fā)作時(shí)部分Albumin 的N-末端受損或被銅占據(jù)，可以做為急性心肌缺血的一種生化標(biāo)志物。目前關(guān)于Retinol-blinding protein4 的國(guó)內(nèi)外研究較少，認(rèn)為其血清水平與動(dòng)脈粥樣硬化呈正相關(guān)，具體作用機(jī)制尚不清晰[29]。故冠心病血瘀證的可能病理機(jī)制還包括心肌缺血、動(dòng)脈粥樣硬化等。

2.4 中醫(yī)藥干預(yù)影響相關(guān)蛋白的表達(dá)

方證結(jié)合是中醫(yī)藥療法的顯著特點(diǎn)，將蛋白組學(xué)研究技術(shù)和策略結(jié)合方證對(duì)應(yīng)思想，不僅能觀察中藥治療冠心病血瘀證前后相關(guān)蛋白的表達(dá)差異，還能探索某些藥物的作用靶點(diǎn)與作用機(jī)制，從而為中藥療效提供證據(jù)支持[30]。

治療冠心病血瘀證常采用活血化瘀、溫陽(yáng)行氣等治法。研究顯示，用于治療胸痹、心痛等心系疾病的部分中藥或中藥有效成分干預(yù)冠心病血瘀證后在蛋白組學(xué)方面顯示出一定的影響。李榮軍等[31]用丹參酮ⅡA 磺酸鈉注射液治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證，在治療前后運(yùn)用標(biāo)記免疫熒光抗體技術(shù)對(duì)進(jìn)行血小板膜糖蛋白檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)治療后反映血小板黏附聚集作用的血小板膜糖蛋白CD63 和PAC-1 表達(dá)水平明顯上調(diào)、CD42b表達(dá)水平明顯下調(diào)，表明丹參酮ⅡA 磺酸鈉注射液可降低冠心病血瘀證患者的血小板活化功能，抑制凝血過(guò)程，有效緩解血瘀證癥狀，與丹參的活血化瘀作用不謀而合。王軍[32]等用谷紅注射液治療冠心病血瘀證患者12天后，采用免疫比濁法檢測(cè)血漿差異蛋白，發(fā)現(xiàn)反映動(dòng)脈粥樣硬化與炎癥反應(yīng)的CD62p和hs-CRP 均顯著下降，表明谷紅注射液具有抗炎、抗血栓形成的功效，其中醫(yī)證候療效有效率高達(dá)90%，說(shuō)明谷紅注射液在緩解血瘀證癥狀方面作用顯著，亦充分驗(yàn)證了中藥紅花活血祛瘀、理氣通經(jīng)的功效。

3 討論

疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程通常由于基因、外界刺激等因素的共同作用，且均伴有相關(guān)生物學(xué)過(guò)程特異蛋白質(zhì)表達(dá)差異。在冠心病蛋白組學(xué)方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已有部分研究成果（如發(fā)現(xiàn)人類血漿HDL 有近50種獨(dú)立的蛋白成分）[33-35]，但在冠心病證具體證候蛋白組學(xué)方面仍處于初步階段。冠心病血瘀證作為冠心病最關(guān)鍵的中醫(yī)證型，尋找其病證結(jié)合診斷標(biāo)記物或預(yù)后因子是心血管領(lǐng)域的重要研究方向，運(yùn)用蛋白組學(xué)技術(shù)方法來(lái)尋找冠心病血瘀證的蛋白標(biāo)記物可為其診斷、治療與預(yù)后起到不可估量的作用。

研究者匯總冠心病血瘀證蛋白組學(xué)研究進(jìn)行篩選后納入14篇高質(zhì)量文獻(xiàn)。根據(jù)納入文獻(xiàn)顯示，目前尋找差異蛋白的冠心病血瘀證蛋白組學(xué)研究方法有以下3種：①冠心病血瘀證患者與健康人對(duì)照；②冠心病血瘀證與非血瘀證患者對(duì)照；③冠心病血瘀證、非血瘀證患者、健康人三者對(duì)照。檢測(cè)相關(guān)蛋白的技術(shù)方法包括雙向凝膠電泳、質(zhì)譜鑒定、ELISA 法、免疫比濁法、發(fā)色底物法等，檢測(cè)到與冠心病血瘀證相關(guān)的差異蛋白種類繁多，涉及病理機(jī)制亦不盡相同。主要與炎癥反應(yīng)、脂代謝紊亂、凝血-纖溶系統(tǒng)異常等病理機(jī)制相關(guān)，與心肌損傷與動(dòng)脈粥樣硬化或存在密切關(guān)系。

綜合分析上述研究結(jié)果，可見(jiàn)將冠心病血瘀證患者與健康人進(jìn)行對(duì)照的研究方法目前最為常用，因其檢測(cè)手段方便易行，得到的差異蛋白種類較多，涉及的病理機(jī)制也最為豐富，包括炎癥反應(yīng)、脂代謝紊亂、凝血-纖溶系統(tǒng)異常、心肌損傷、動(dòng)脈粥樣硬化等，但結(jié)果可能包含冠心病相關(guān)蛋白，而非血瘀證證型相關(guān)蛋白；對(duì)照冠心病血瘀證患者與非血瘀證患者的研究較少，檢測(cè)手段相對(duì)復(fù)雜，得到的差異蛋白種類雖多但主要涉及凝血-纖溶系統(tǒng)異常，可見(jiàn)其對(duì)血瘀證的特異度較高，不過(guò)可能會(huì)排除部分差異蛋白從而遺漏一些重要的病理過(guò)程，而且冠心病非血瘀證只是排除了血瘀證的診斷，可能包含其他中醫(yī)證型，不能排除得到的差異蛋白實(shí)則為其他證型（如氣虛證、痰濁證）的相關(guān)蛋白而非血瘀證，需進(jìn)一步與其他證型相關(guān)蛋白進(jìn)行對(duì)比；將冠心病血瘀證患者、冠心病非血瘀證患者、健康人進(jìn)行對(duì)照的研究數(shù)量介于以上2種研究方法之間，其檢測(cè)手段主要為免疫比濁法、ELISA法等，得到的差異蛋白數(shù)量較少，涉及的病理機(jī)制主要為免疫反應(yīng)、脂代謝紊亂、凝血系統(tǒng)異常3種，既可避免第1種方法中證候特異性低的問(wèn)題，也可通過(guò)健康對(duì)照來(lái)排除其他證型相關(guān)蛋白，故得到的結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確，代表性較高。

本研究創(chuàng)新性地匯總分析了近年來(lái)冠心病血瘀證蛋白組學(xué)的具體研究方法，并根據(jù)不同的研究方法探索其對(duì)差異蛋白結(jié)果及涉及病理機(jī)制的影響，有助于今后臨床研究者對(duì)于冠心病血瘀證的進(jìn)一步探索，對(duì)于臨床診斷與治療具有指導(dǎo)意義。故在今后冠心病血瘀證蛋白組學(xué)研究中，推薦臨床科研人員根據(jù)研究?jī)?nèi)容選擇合適的研究方法進(jìn)行研究設(shè)計(jì)，應(yīng)更加著眼于涉及病理機(jī)制中重要信號(hào)通路內(nèi)關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，從而精準(zhǔn)服務(wù)于中西醫(yī)病證結(jié)合的診斷、治療與預(yù)后過(guò)程。