陸紫敏，李雪晨，方 琦，王加勇

同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院輸血科，上海 200065

造血干細胞移植或細胞治療已成為治療多種血液病及非血液系統(tǒng)疾病的重要方法。近年來，用血細胞分離機采集外周血造血干細胞(PBSC)已逐漸成為造血干細胞移植或治療的主要方法，能否采集到足夠數(shù)量具有活性的PBSC是干細胞移植或治療成功的關(guān)鍵。目前對PBSC采集前多采用重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)進行動員[1-2]，但對PBSC采集前未采用rhG-CSF動員(簡稱“未動員”)的相關(guān)研究國內(nèi)外報道甚少。本研究對112例未動員的健康供者采集其PBSC進行研究，比較分析男女兩組供者采集前血常規(guī)指標及采集物指標，并將采集效果與部分影響因素進行相關(guān)分析，為進一步提高未動員供員PBSC的采集效果提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院的健康PBSC供者共112例為研究對象，其中男59例，女53例。所有入組供者采集前均未應(yīng)用rhG-CSF進行動員，所有供者均為自愿捐獻，通過體格檢查篩除感染性疾病、慢性系統(tǒng)性疾病及其他不適于捐獻情況的人員，合格供者均簽署知情同意書。所有入組供者采集前均檢測白細胞(WBC)計數(shù)、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、血細胞比容(Hct)、血小板(PLT)計數(shù)、血紅蛋白(Hb)、單個核細胞(MNC)計數(shù)等血常規(guī)指標。

1.2方法

1.2.1采集方法 所有研究對象采集的目標細胞為MNC，多用于嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)療法，每份PBSC所采集的MNC計數(shù)目標閾值為>1×109/L，每袋終產(chǎn)品量為40～60 mL。均使用MCS+血細胞分離機(美國血液技術(shù)公司)及PBSC專用一次性管道(美國血液技術(shù)公司)進行采集。以血液保存液(ACD，上海輸血技術(shù)有限公司)為抗凝劑。輸入采集者性別、身高、體質(zhì)量、外周血Hct，按PBSC程序單采，每次循環(huán)總血量2 000～6 000 mL，全血與抗凝劑比例為12∶1，采集速度為20～50 mL/min，采集時間90～180 min。所有入組的采集者術(shù)前均口服10%葡萄糖酸鈣50 mL，以防枸櫞酸鈉中毒。

1.2.2檢測方法 取混勻后的少許PBSC采集物懸液采用XS-800i全自動血細胞分析儀(日本Sysmex公司)進行WBC計數(shù)，瑞氏染色顯微鏡下行MNC分類，采用FC-500流式細胞儀(美國Beckman coulter公司)進行CD34+計數(shù)。MNC、WBC、CD34+計數(shù)的檢測均由專人負責(zé)。

1.2.3采集物分析 分析年齡、BMI、采集前血常規(guī)指標、采集循環(huán)血容量、處理血量及循環(huán)次數(shù)等因素對男女兩組供者所采集獲得的MNC計數(shù)、CD34+計數(shù)的影響；比較分析入組的男女兩組供者采集前血常規(guī)指標及采集過程、采集物等指標。MNC百分比、WBC計數(shù)以及采集血量的乘積即為MNC計數(shù)。CD34+百分比、WBC計數(shù)以及采集血量的乘積即為CD34+計數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1采集效果 采集的112份PBSC的MNC百分比為42.11%±18.47%，CD34+百分比為0.945%±0.760%，WBC計數(shù)為(89.94±28.27)×109/L，MNC計數(shù)為(1.57±0.82)×109/L，CD34+計數(shù)為(3.40±2.76)×107/L。

2.2不同性別采集前指標、采集物參數(shù)比較 男性組年齡，BMI，采集前WBC計數(shù)、Hct、Hb，總循環(huán)血量高于女性組(P<0.05)，而采集處理血量、采集物中MNC計數(shù)低于女性組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組采集前PLT計數(shù)、MNC百分比、MNC計數(shù)以及采集產(chǎn)品量、采集循環(huán)數(shù)、采集物中CD34+計數(shù)和WBC計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1、2。

表1 兩組采集前血常規(guī)及相關(guān)參數(shù)比較

表2 兩組PBSC采集過程中、采集物中相關(guān)指標比較

2.3影響采集效果的多元回歸分析 分別對男女兩組供者的年齡、BMI、采集前血常規(guī)指標以及采集循環(huán)數(shù)、循環(huán)血量等因素與采集物MNC、CD34+計數(shù)的影響因素進行分析。結(jié)果顯示，在男性組中，采集物中MNC計數(shù)的影響因素為采集循環(huán)數(shù)(P=0.018)，采集物中CD34+計數(shù)的影響因素為采集前PLT計數(shù)(P=0.048)，見表3、4。女性組年齡、采集前PLT計數(shù)、WBC計數(shù)、MNC百分比、MNC計數(shù)是采集物中MNC計數(shù)的影響因素(P<0.05)，采集前Hct、PLT計數(shù)及采集處理血量是采集物中CD34+計數(shù)的影響因素(P<0.05)，見表5、6。

表3 影響男性采集物中MNC計數(shù)的多元線性回歸分析

表4 影響男性采集物中CD34+計數(shù)的多元線性回歸分析

表5 影響女性采集物中MNC計數(shù)的多元線性回歸分析

續(xù)表5 影響女性采集物中MNC計數(shù)的多元線性回歸分析

表6 影響女性采集物中CD34+計數(shù)的多元線性回歸分析

3 討 論

PBSC采集被廣泛應(yīng)用于臨床治療主要是由于采集者無須麻醉，失血和創(chuàng)傷性小，然而影響PBSC采集數(shù)量和質(zhì)量的因素較多，目前對于采用rhG-CSF動員的PBSC采集效果和影響因素研究較多[3]。從理論上講，采用rhG-CSF進行動員的PBSC采集效果比未動員的PBSC采集效果要好，但動員的費用較高且存在采集者用藥期間出現(xiàn)不同程度全身不適癥狀如發(fā)熱、肌肉和骨骼酸痛等問題[4]，因此容易遭到采集者拒絕。

本研究納入的112例健康供者采集前均未采用rhG-CSF進行動員，PBSC采集物中WBC計數(shù)、MNC計數(shù)、CD34+計數(shù)以及MNC、 CD34+百分比水平分別為(89.94±28.27)×109/L、(1.57±0.82)×109/L、(3.40±2.76)×107/L、42.11%±18.47%、0.945%±0.760%，顯示未動員的供者其外周血中存在能夠安全采集到所要求的MNC目標數(shù)量，同時也顯示采集到一定數(shù)量的CD34+細胞。

如何對供者采集到質(zhì)量更高、數(shù)量更多的MNC及CD34+細胞是PBSC應(yīng)用于臨床治療成功的關(guān)鍵[5]。本研究對男女兩組健康供者進行比較分析，結(jié)果顯示，男性組年齡，BMI，采集前Hct、Hb、WBC計數(shù)，總循環(huán)血量均高于女性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而男性組采集處理血量、采集物中MNC計數(shù)低于女性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組采集前PLT計數(shù)、MNC百分比以及采集產(chǎn)品量、采集循環(huán)數(shù)、采集物中CD34+計數(shù)、MNC計數(shù)和WBC計數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示入組的男女性供者年齡、體質(zhì)量、身高存在一定差異，采集前Hct、Hb、WBC計數(shù)等指標也存在差異，均表現(xiàn)為男性高于女性，這可能與男性體表面積大，與之相應(yīng)的外周血Hct、Hb、WBC計數(shù)也較高。本研究還發(fā)現(xiàn)，即使男女兩組的采集產(chǎn)品量、采集循環(huán)數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，男性組采集的總循環(huán)血量卻高于女性組，而采集處理血量、采集物中MNC計數(shù)卻低于女性組，提示供者因年齡、性別、采集處理血量等不同可致采集效果不一致，這與張淑遐等[6]報道結(jié)果不符，其原因可能是與采集前是否采用rhG-CSF動員有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，男女兩組采集物中CD34+計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與張曦等[7]報道結(jié)果一致。有關(guān)年齡、性別不同是否可導(dǎo)致采集物中的MNC計數(shù)、循環(huán)血量、采集處理血量等變化不一致，還有待進一步大樣本研究。

有學(xué)者認為，采集物中MNC及CD34+計數(shù)是判斷PBSC采集效果的重要指標[8]，而采集效果受多種因素影響，有關(guān)采集前外周血常規(guī)指標、采集處理血量對未動員供者PBSC采集效果影響的研究國內(nèi)外報道甚少。本研究分別對男女兩組采集物中MNC、CD34+計數(shù)的影響因素進行分析。結(jié)果顯示，女性組年齡、采集前PLT計數(shù)、WBC計數(shù)、MNC百分比、MNC計數(shù)是采集物中MNC計數(shù)的影響因素(P<0.05)，即年齡、PLT計數(shù)、WBC計數(shù)、MNC百分比越高，所獲得的MNC計數(shù)越高，與國內(nèi)報道結(jié)果相似[9]。由此可推測女性的年齡高低，PLT計數(shù)、WBC計數(shù)、MNC百分比水平能反映骨髓造血情況，這為提前預(yù)測PBSC的采集效果，進行采集量的控制提供了一定的參考。本研究還發(fā)現(xiàn)，男女兩組采集前PLT計數(shù)為采集物中CD34+計數(shù)的影響因素(P<0.05，β<0)，即采集前PLT計數(shù)越高，所獲的CD34+計數(shù)越低。這結(jié)果與張淑遐等[6]報道結(jié)果不一致，可能原因如下：(1)與采集前是否采用rhG-CSF動員有關(guān)；(2)PLT比重接近干細胞，更容易被采集到干細胞成品中而影響采集效果；(3)PLT計數(shù)增加使黏滯性和聚集性增加，直接影響探測器對細胞的識別[10]。本研究還發(fā)現(xiàn)，女性組采集前Hct及采集處理血量是采集物中CD34+計數(shù)的影響因素(P=0.008、0.049，β=1.187、0.004)，即Hct升高、采集處理血量越多，獲得CD34+計數(shù)越高。有研究顯示，采集物中CD34+計數(shù)還與采集產(chǎn)品量、總循環(huán)血量等有關(guān)[8]。本研究采集產(chǎn)品量、總循環(huán)血量均遠低于PBSC移植所需要的產(chǎn)品量和循環(huán)血量[1]，因此所獲采集物中MNC、CD34+計數(shù)也遠低于移植成功所需要的細胞數(shù)[11]。

綜上所述，應(yīng)用血細胞分離機對未動員健康供者進行PBSC采集，不僅安全性、采集成功率較高，且能采集到滿足臨床CAR-T細胞療法所需要的MNC閾值，以及一定數(shù)量的CD34+細胞。健康供者不同年齡、性別、總循環(huán)血量等可致采集效果不一致；采集前血常規(guī)中PLT計數(shù)有助于預(yù)測PBSC采集效果，其成本低、操作簡單方便，具有一定的臨床意義。