易泓汝 白麗麗 潘曉芬

摘要? ? 通過醇提法提取新鮮球菊抗氧化性有效成分。以蘆丁為參照品、硝酸鋁為顯色劑測(cè)定黃酮含量。通過測(cè)定三價(jià)鐵離子的還原能力和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率檢測(cè)黃酮的抗氧化活性。結(jié)果表明，當(dāng)固液比為1∶35時(shí)，用95 %乙醇在50 ℃條件下浸提球菊4 h時(shí)，黃酮含量達(dá)到最高（7.61 mg/g）;球菊醇提物對(duì)Fe3+有較強(qiáng)的還原能力，并能夠較好地清除DPPH自由基。本研究結(jié)果可為今后開發(fā)球菊抗氧化活性成分提供參考。

關(guān)鍵詞? ? 球菊;黃酮;抗氧化活性成分

Abstract? ? The antioxidant effective components of fresh Epaltes australis Less. were extracted by the method of ethanol extraction.The flavonoid content was determined by using rutin as reference material and aluminum nitrate as color reagent.The antioxidant activity was detected by measuring the reducing ability of Fe3+ and the radical scavenging rate of 1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine （DPPH）.The results showed that the flavonoid yield was the highest （7.61 mg/g） when solid-liquid ratio was 1∶35 and immersed in 95% ethanol at 50 ℃ for 4 h;the ethanol extraction of Epaltes australis Less. had a strong reducing ability to Fe3+ and the DPPH free radical could be eliminated well. The results of this study provide references for the future development of antioxidant effective components of Epaltes australis Less.

Key words? ? Epaltes australis Less.;flavonoid;antioxidant effective component

球菊（Epaltes australis Less.）是被子植物門菊科球菊屬的一年生草本植物，廣泛分布于印度、泰國(guó)、中南半島、馬來西亞至澳大利亞等地及中國(guó)臺(tái)灣、福建、廣東及其南部沿海島嶼、廣西及云南等地[1]。菊科植物主要化學(xué)成分為黃酮、多酚、多糖及揮發(fā)油等，具有廣泛的藥理作用，其主要活性物質(zhì)為黃酮類化合物，該化合物含量的高低可作為評(píng)價(jià)其藥用價(jià)值的主要標(biāo)志[2-6]。菊科植物具有顯著的抗氧化特性，是一類具有開發(fā)前景的天然藥物。雖然菊科植物的抗氧化活性已有很多研究報(bào)道[7-9]，但是球菊的抗氧性研究鮮少報(bào)道。本文通過對(duì)球菊抗氧化活性的研究，分析總黃酮含量及其對(duì)DPPH自由基的清除能力，以期為今后開發(fā)球菊抗氧化活性成分提供參考。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗(yàn)材料

供試材料為球菊，購(gòu)于花店;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%），由上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn);亞硝酸鈉、無水乙醇、95%乙醇、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉和磷酸一氫鈉均購(gòu)于西隴科學(xué)股份有限公司;硫酸鋁、鐵氰化鉀、三氯乙酸和三氯化鐵均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;75%乙醇購(gòu)于佳林漓峰醫(yī)藥用品有限責(zé)任公司;1，1二苯基-2-三硝基苯（含量10%～20%）購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;85%乙醇為自配;去離子水為自制。

1.2? ? 儀器與設(shè)備

真空干燥箱（DZF-6021型），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn);離心機(jī)（TGL-16G型），上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn);紫外可見分光光度計(jì)（UV-1800型），上海奧析科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);電子天平（FA1104型），上海良平儀器儀表有限公司生產(chǎn);集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S型），河南予華儀器有限公司生產(chǎn);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA型），上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn);SHZ-D循環(huán)水式多用循環(huán)泵，鞏義市英峪高科儀器廠生產(chǎn)。

1.3? ? 試驗(yàn)方法

1.3.1? ? 黃酮含量的測(cè)定。采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH可見分光光度法測(cè)定球菊中總黃酮含量[10]。其基本原理為黃酮類化合物在堿性條件下與Al（NO3）3和NaNO2發(fā)生絡(luò)合顯色反應(yīng)。

（1）繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品50 mg于25 mL容量瓶中，加入適量無水乙醇溶解，置水浴中加熱輔助溶解，放冷，稀釋至刻度搖勻。精確量取10.0 mL置于100 mL容量瓶，用蒸餾水定容，搖勻，作為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液使用。分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL，分別加入25 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至12.0 mL，再分別加入5% NaNO2溶液1.0 mL，放置6 min，接著加入10% Al（NO3）3溶液1.0 mL，放置6 min，再加入4% NaOH溶液10.0 mL，放置15 min，加蒸餾水定容至25 mL、搖勻。以空白組（不加顯色劑）為參比溶液，在510 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）乙醇浸提法提取球菊黃酮。將球菊樣品置于烘箱中干燥，然后粉碎。精密稱取球菊干燥粉末1.0 g，加入一定的乙醇，浸泡一段時(shí)間之后將樣品溶液離心分離。取上清液并在一定溫度下進(jìn)行濃縮，將濃縮液用乙醇定容至25.0 mL。精密吸取1.0 mL待測(cè)液，測(cè)定吸光度A。對(duì)照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮化合物得率[11]。計(jì)算公式如下：

黃酮化合物的含量（mg/g）=C×V1×V3 /（W×V2）

式中：C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到樣品中黃酮類物質(zhì)濃度;V1為提取液總體積（mL）;V2為測(cè)定取量體積（mL）;V3為顯色定容反應(yīng)定容體積（mL）;W為樣品質(zhì)量（g）。

（3）黃酮含量的影響因素。①時(shí)間對(duì)黃酮含量的影響。當(dāng)球菊與75%乙醇的固液比為1∶25時(shí)，在50 ℃條件下分別浸泡球菊2、3、4、5 h，得到球菊醇提物，測(cè)定吸光度。②溫度對(duì)黃酮含量的影響。分別在40、50、60、70 ℃條件下按球菊與75%乙醇的固液比為1∶25浸泡球菊4 h，得到球菊醇提物，測(cè)定吸光度。③固液比對(duì)黃酮含量的影響。在50 ℃條件下，將球菊粉末與75%酒精按固液比為1∶25、1∶30、1∶35、1∶40浸泡球菊4 h，提取黃酮，測(cè)定吸光度。④乙醇濃度對(duì)黃酮含量的影響。在50 ℃條件下，按球菊粉末與乙醇固液比為1∶35，分別用75.0%、85.0%、95.0%、99.9%的乙醇浸泡球菊4 h，提取黃酮，測(cè)定吸光度。

1.3.2? ? 黃酮對(duì)DPPH自由基的清除作用研究。精密稱取4.0 mg DPPH粉末，加50 mL無水乙醇溶液溶解，定容至100 mL，作為儲(chǔ)備液，放在避光處保存。將提取出的黃酮浸膏溶解，配制不同濃度的溶液，作為待測(cè)液，研究黃酮對(duì)DPPH自由基的清除作用[12]。

（1）測(cè)光吸收值A(chǔ)1。取待測(cè)液1 mL于5 mL離心管中，并加入DPPH溶液3 mL，混合均勻，在室溫下離心20 min（3 500 r/min），取適量上清液在517 nm處測(cè)定光吸收值A(chǔ)1。

（2）測(cè)光吸收值A(chǔ)2。取待測(cè)液1 mL于5 mL離心管中，并加入無水乙醇3 mL，然后在室溫下離心20 min（3 500 r/min），取適量上清液在517 nm處測(cè)光吸收值A(chǔ)2。

（3）測(cè)光吸收值A(chǔ)0。取無水乙醇溶液1 mL于5 mL離心管中，并加入DPPH溶液3 mL，然后在室溫下離心20 min（3 500 r/min），取適量上清液在517 nm處測(cè)定光吸收值A(chǔ)0。

式中，E（DPPH）為總黃酮提取液對(duì)DPPH自由基的清除率（%）;A0為DPPH溶液與無水乙醇反應(yīng)后的吸光度;A1為DPPH溶液+總黃酮提取液的吸光度;A2為無水乙醇+總黃酮提取液的吸光度。

1.3.3? ? 黃酮還原能力的測(cè)定。分別取5支10 mL比色管，依次加入不同濃度的待測(cè)液2.5 mL磷酸鹽緩沖液（2.0 mol/L，pH值為6.6）2.5 mL和1%鐵氰化鉀2.5 mL，混勻后置于50 ℃水浴反應(yīng)20 min，再加入10%三氯乙酸2.5 mL，混勻，離心（3 500 r/min）。取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL和0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL于試管內(nèi)混勻，再在700 nm處測(cè)定吸光度值[13]。試驗(yàn)重復(fù)3次。若吸光度越大，則還原能力越強(qiáng)，物質(zhì)的還原能力與其抗氧化能力有顯著相關(guān)性。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

由圖1可知，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得線性回歸方程為y=14.386x-0.188 7，R2=0.991 5，表明蘆丁的吸光度與濃度成良好的線性關(guān)系。

2.2? ? 不同因素對(duì)黃酮含量的影響

2.2.1? ? 浸泡時(shí)間對(duì)黃酮含量的影響。由表1可知，球菊與75%乙醇按固液比為1∶20，并在50 ℃條件下浸泡，不同浸泡時(shí)間，黃酮含量不同。當(dāng)浸泡2～4 h時(shí)，球菊中黃酮含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，其中浸泡時(shí)間為4 h時(shí)黃酮含量最高（6.15 mg/g）;但隨時(shí)間的延長(zhǎng)（5 h），黃酮提取率有所降低?？赡苁怯捎诮輹r(shí)間長(zhǎng)，球菊所含黃酮發(fā)生氧化生成醌，導(dǎo)致球菊黃酮含量降低。

2.2.2? ? 不同溫度對(duì)黃酮含量的影響。當(dāng)球菊和75%乙醇按固液比為1∶20于40～70 ℃浸泡4 h時(shí)，其黃酮含量如表2所示。當(dāng)溫度為40～50 ℃時(shí)，黃酮含量隨溫度的升高而增大，其中溫度為50 ℃時(shí)黃酮含量最高（6.15 mg/g）;但隨溫度的升高（60～70 ℃），黃酮含量減少，可能是由于溫度高會(huì)加速黃酮的氧化，導(dǎo)致球菊黃酮提取率降低。

2.2.3? ? 不同固液比對(duì)黃酮含量的影響。當(dāng)固液比為1∶20～40，在50 ℃條件下浸泡球菊4 h時(shí)，其黃酮含量如表3所示。當(dāng)固液比為1∶20～35時(shí)，黃酮含量隨提取溶劑量的增大而增大，且當(dāng)固液比為1∶35時(shí)黃酮含量最高（6.63 mg/g）。但隨提取劑用量繼續(xù)增大，球菊中黃酮含量降低。

2.2.4? ? 不同乙醇濃度對(duì)黃酮含量的影響。當(dāng)固液比為1∶35，用75%～100%乙醇在50 ℃條件下浸泡球菊4 h時(shí)，其黃酮含量如表4所示。當(dāng)乙醇濃度為75%～95%時(shí)，黃酮含量隨乙醇濃度的升高而增大，其中用95%提取時(shí)黃酮含量最高（7.61 mg/g）;而后隨乙醇濃度的升高（100%），黃酮含量有所下降，可能是由于所用溶劑的極性減小，導(dǎo)致球菊的部分黃酮溶解度降低。

2.3? ? 黃酮對(duì)DPPH清除作用的影響

由表5可知，加入等量體積（3 mL）的DPPH后，當(dāng)樣品液濃度為0.5～4.0 mg/mL時(shí)，吸光度A1隨樣品溶液濃度增加而減小。當(dāng)樣品液濃度為2.5 mg/mL時(shí)，繼續(xù)加大樣品濃度，吸光度A1減小的幅度變小。說明黃酮濃度的升高有利于清除DPPH自由基，當(dāng)清除到一定程度時(shí)，降低黃酮濃度，清除DPPH自由基的能力下降。當(dāng)待測(cè)液加入等量體積（3.0 mL）的無水乙醇后，樣品液濃度為1.5～4.0 mg/mL時(shí)，吸光度A2大致呈現(xiàn)增大的趨勢(shì);而在0.5～1.5 mg/mL時(shí)，可能由于樣品濃度過小和儀器系統(tǒng)誤差導(dǎo)致反常的結(jié)果，但是數(shù)值變動(dòng)非常小。