(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/國家小麥改良中心云南分中心，昆明 650200)

小麥是我國三大主要口糧作物之一，其產(chǎn)量高低直接關(guān)系到國家的糧食安全，并在人們的膳食結(jié)構(gòu)中具有重要地位。提高小麥產(chǎn)量一直是小麥育種者的首要目標。而株高是小麥重要的農(nóng)藝性狀，對產(chǎn)量具有重要影響。隨著育種中矮稈基因的廣泛應(yīng)用，矮稈和半矮稈小麥品種的育成和推廣對全球小麥株高的降低和產(chǎn)量的提高起了十分關(guān)鍵的作用[1]。小麥的株高性狀受多個基因控制，其中來自農(nóng)林10號的Rht-B1b、Rht-D1b和赤小麥的Rht8是小麥育種和生產(chǎn)中常見基因[2-4]。千粒重作為小麥產(chǎn)量構(gòu)成三要素之一，研究表明，千粒重與產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系[1,5-7]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了多個控制小麥千粒重的基因位點，如TaCwi-A1、TaGW2-6A與TaSus2-2B等產(chǎn)量相關(guān)基因?qū)π←溓ЯＶ?、粒寬等性狀均具有調(diào)控作用，可直接影響小麥產(chǎn)量的高低[8-10]。因此，研究上述小麥株高和千粒重相關(guān)功能基因的分布，對于提高產(chǎn)量潛力和改良株高具有重要作用。

分子標記已廣泛應(yīng)用于上述小麥株高和千粒重相關(guān)功能基因的檢測鑒定。在矮稈基因方面，已開發(fā)了可準確鑒定Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8等基因的功能標記[11,12]，國內(nèi)多位學(xué)者利用這些功能標記分別對我國不同麥區(qū)矮稈基因的分布情況進行了研究[13-18]。在千粒重相關(guān)基因方面，已開發(fā)出粒重相關(guān)基因TaGW2-6A、TaCwi-A1和TaSus2-2B等的功能標記[8-10]，多位學(xué)者已分別對TaGW2-6A、TaCwi-A1、TaSus2-2B基因位點的功能標記在不同材料中進行了標記檢測和實用性驗證[19-25]。

KASP(Kompetitive allele specific PCR)技術(shù)，即競爭性等位基因特異性PCR技術(shù)，具有高度穩(wěn)定性、準確性和低成本的特點，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于高通量SNP分型以及InDels檢測[26]。Rasheed等[27]、Khalid等[28]利用這一簡便高效的技術(shù)，開發(fā)了矮稈基因Rht-B1、Rht-D1和千粒重功能基因TaSus2-2B、TaCwi-A1、TaGW2-6A的KASP標記，能實現(xiàn)基因的快速準確檢測，并利用多份小麥材料進行了驗證。云南地處云貴高原，具有獨特立體生態(tài)氣候，小麥產(chǎn)量水平低，產(chǎn)量性狀一直是云南小麥遺傳改良的重要目標。研究云南小麥株高和千粒重相關(guān)功能基因分布及其基因組成，對該地區(qū)小麥產(chǎn)量相關(guān)性狀遺傳改良具有重要意義。但迄今未有株高和粒重相關(guān)基因的功能標記對云南小麥品種(系)進行標記檢測的研究報道，制約了云南小麥產(chǎn)量性狀遺傳改良工作的開展。本研究利用矮稈基因Rht-B1、Rht-D1的KASP標記Rht-B1_SNP、Rht-B1_160IND、Rht-B1_197IND、Rht-D1_SNP和千粒重相關(guān)功能基因TaCwi-A1、TaGW2-6A、TaSus2-2B的KASP標記TaCwi、TaGW2-6A、TaSus2-2B_SNP，對42份云南省育成小麥品種(系)進行基因單倍型檢測鑒定，旨在了解云南小麥品種(系)中株高和千粒重相關(guān)功能基因的分布狀況，篩選含有目標基因的優(yōu)異小麥種質(zhì)，為云南省小麥產(chǎn)量相關(guān)性狀的遺傳改良提供材料和方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用材料為42份云南育成小麥品種和育成高代品系，供試材料分別由云南省內(nèi)相關(guān)育種單位選育。供試材料詳見表1。

1.2 基因組DNA提取

每份材料取8～10粒種子置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿室溫下培養(yǎng)，萌發(fā)后7 d取幼苗葉片，用CTAB法[29]提取基因組DNA。

1.3 KASP標記檢測

供試材料的KASP標記檢測由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所何中虎老師課題組進行。試驗所用2個矮稈基因和3個千粒重基因的KASP標記引物來源于Rasheed等[27]設(shè)計或Khalid等[28]報道，引物序列詳見表2。PCR反應(yīng)體系為10μL，包括4.78μL DNA(5～50 ng·μL-1)，5μL KASP MasterMix(LGC公司，英國)，0.14μL KASP Assay Mix，0.08μL Mg2+。KASP Assay Mix由3條引物稀釋獲得，按FAM-引物(100μmol·L-1)∶HEX-引物(100μmol·L-1)∶通用引物(100μmol·L-1)∶ddH2O=12∶12∶30∶46的比例混合而成。PCR反應(yīng)在Bio-Rad CFX 96 PCR儀上(Bio-Rad，美國)上進行。每次反應(yīng)設(shè)置空白對照組，其DNA模板用ddH2O代替。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃熱處理15 min；95 ℃變性20 s，65～55 ℃退火和延伸25 s，10個循環(huán)(每循環(huán)降低1.0 ℃)；95 ℃變性10 s，57 ℃退火和延伸1 min，30個循環(huán)；4 ℃避光保存。反應(yīng)結(jié)束后進行熒光掃描，并作基因分型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 株高矮稈基因Rht-B1和Rht-D1的KASP標記檢測

利用Rht-B1_SNP、Rht-B1_160IND、Rht-B1_197IND標記和Rht-D1_SNP標記分別對42份供試品種(系)株高矮稈基因Rht-B1和Rht-D1進行檢測，標記的基因分型結(jié)果和頻率分布結(jié)果分別列于表1和表3。結(jié)果表明，15份品種(系)為Rht-B1基因的矮稈基因單倍型Rht-B1b/Rht-B1a+197 bp，頻率為35.71%；11份品種(系)為Rht-D1基因的矮稈基因單倍型Rht-D1b，頻率為26.19%?；蛐徒M合分析發(fā)現(xiàn)，42份供試材料中共有5種株高矮稈基因型組合，其中17份品種(系)為Rht-B1a/Rht-D1a單倍型組合，頻率為40.48%；10份品種(系)為Rht-B1a/Rht-D1b單倍型組合，頻率為23.81%；2份品種(系)云麥51和云麥73為Rht-B1a+197bp/Rht-D1a單倍型組合，頻率為4.76%；12份品種(系)為Rht-B1b/Rht-D1a單倍型組合，頻率為28.57%；1份品種(系)云麥53為Rht-B1b/Rht-D1b單倍型組合，頻率為2.38%。

表1 42份云南小麥株高和千粒重的KASP標記基因分型

注：N表示無檢測信號。

表2 矮稈和千粒重相關(guān)功能基因的KASP標記引物

注：波浪線標注序列為FAM標簽序列，下劃線標注序列為HEX標簽序列。

表3 42份云南小麥中株高和千粒重相關(guān)功能基因的分布頻率

2.2 千粒重基因TaCwi-A1、TaGW2-6A和TaSus2-2B的KASP標記檢測

利用TaCwi標記、TaGW2-6A標記和TaSus2-2B_SNP標記分別對42份供試品種千粒重相關(guān)功能基因TaCwi-A1、TaGW2-6A和TaSus2-2B進行檢測，標記的基因分型結(jié)果和頻率分布結(jié)果分別列于表2和表3。結(jié)果表明，18份品種(系)為TaCwi-A1基因的高千粒重單倍型TaCwi-A1a，頻率為42.86%；16份品種(系)為TaGW2-6A基因的高千粒重單倍型Hap-6A-A，頻率為38.10%；30份品種(系)為TaSus2-2B基因的高千粒重單倍型Hap-H，頻率為71.43%。基因型組合分析發(fā)現(xiàn)，聚合3個千粒重基因高粒重單倍型(TaCwi-A1a/Hap-6A-A/Hap-H)的小麥品種(系)有5份，分別是云麥76、云麥78、云154-65、文D6-8、靖麥12，頻率為11.90%；聚合3個千粒重基因低粒重單倍型(TaCwi-A1b/Hap-6A-G/Hap-L)的小麥品種(系)有7份，分別是云麥39、云麥54、云麥69、云麥72、云麥73，云16D4-13、鳳麥38，頻率為16.67%。

3 討 論

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，KASP檢測、育種芯片等分子育種技術(shù)逐漸被育種家采用。利用簡便高效的高通量KASP檢測技術(shù)，在小麥上已開發(fā)了120余個能有效鑒定80余個小麥產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性和適應(yīng)性相關(guān)基因的高通量KASP功能標記，為小麥重要性狀功能基因的快速檢測提供了新的檢測方法[27-28,30]。國內(nèi)學(xué)者分別利用KASP功能標記對不同類型小麥品種的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性和適應(yīng)性相關(guān)基因進行檢測分析，認為KASP標記輔助選擇能顯著地提高小麥育種效率[31-33]。本研究利用株高矮稈基因Rht-B1、Rht-D1的KASP標記和千粒重相關(guān)功能基因TaCwi-A1、TaGW2-6A、TaSus2-2B的KASP標記準確、快速地鑒定出上述功能基因在云南小麥品種(系)中的分布狀況，為云南省小麥產(chǎn)量相關(guān)性狀的遺傳改良提供了材料和方法。

矮化是小麥高產(chǎn)育種的重要途徑，株高的降低有助于提高抗倒性和收獲指數(shù)，實現(xiàn)產(chǎn)量潛力提升[1]。控制小麥株高的矮稈基因很多，其中來自農(nóng)林10號的Rht-B1b、Rht-D1b和赤小麥的Rht8等3個基因是小麥育種和生產(chǎn)中利用最普遍的矮稈基因[2-4]。本研究中，Rht-B1b在供試材料中的分布頻率(35.71%)大于Rht-D1b(26.19%)，這與前人研究結(jié)果[13,15,16,31]不一致。不同麥區(qū)的氣候地理條件、育種中所選用的親本材料不同可能是造成矮稈基因頻率不同的原因。通過本研究發(fā)現(xiàn)部分品種的實際株高與基因檢測結(jié)果并不十分吻合，如云麥78、靖麥74和宜麥3號等生產(chǎn)中平均株高低于80 cm，比大部分含有矮稈基因的小麥品種平均株高還低，但基因型檢測為Rht-B1a/Rht-D1a野生單倍型組合。其原因可能在于這些品種可能含有尚未檢出的其他矮稈基因，這有待繼續(xù)進行深入研究。

提高小麥千粒重是提高產(chǎn)量的重要途徑之一[1]，但千粒重是受多個微效基因控制的數(shù)量性狀，在常規(guī)育種表型選擇中存在較大的困難。TaCwi-A1、TaGW2-6A與TaSus2-2B等產(chǎn)量相關(guān)基因?qū)π←溓ЯＶ?、粒寬等性狀均具有調(diào)控作用，可直接影響小麥產(chǎn)量的高低[8-10]。本研究檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在供試材料中TaCwi-A1基因高千粒重單倍型TaCwi-A1a的分布頻率為42.86%，TaGW2-6A基因高千粒重單倍型Hap-6A-A的分布頻率為38.10%，TaSus2-2B基因高千粒重單倍型Hap-H的分布頻率為71.43%，這與前人研究結(jié)果存在較大差異[19,25]。這可能與云南獨特氣候地理條件和高產(chǎn)育種中親本材料選擇有關(guān)。通過本研究同樣發(fā)現(xiàn)部分品種的實際千粒重與基因檢測結(jié)果并不十分吻合，如云麥78、云154-65等品種生產(chǎn)中平均千粒重僅40 g左右，但基因型檢測為TaCwi-A1a/Hap-6A-A/Hap-H高粒重單倍型組合。這說明千粒重是由多基因位點控制的，品種實際粒重表現(xiàn)是多種基因以及生長環(huán)境田間共同作用的結(jié)果，品種產(chǎn)量性狀評價需兼顧表型和基因性，同時需繼續(xù)發(fā)掘其他相關(guān)基因位點的功能，才能更好地在產(chǎn)量性狀遺傳改良分子標記輔助育種中應(yīng)用。