李珂楠，楊成龍2，范竟超

(1.河南省商丘醫(yī)學高等?？茖W校，河南 商丘 476000；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學院亞熱帶作物研究所，貴州 興義 562400)

芍藥(Paeonialactiflora)，別名將離、余容、婪尾春、犁食，屬于芍藥科芍藥屬草本或木本多年生植物。芍藥屬植物在中國分布廣泛，有16個野生種在我國南北有分布，而且還有數(shù)百個芍藥栽培品種分布。芍藥是中國的傳統(tǒng)名花之一，耐寒冷，不耐澇，喜冷涼天氣，與“花中之王”牡丹齊名。芍藥栽培管理粗，適應性強，且屬藥用兼觀賞類植物，為切花和園林綠化的優(yōu)良花卉植物種類。目前，在安徽亳州、河南洛陽等地已逐漸發(fā)展栽培、研究中心，并形成了規(guī)模化商品性生產(chǎn)；而在美國、加拿大、新西蘭等國也有芍藥的栽培和應用。

芍藥之名首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，已有3000多年的栽培歷史?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》稱芍藥可“止痛”，能治“邪氣腹痛，除血痹，破堅積”。張仲景《傷寒論》芍藥甘草湯宗《素問。陰陽應象大論》：“肝苦急，急食甘以緩之”之則。芍藥配甘草，酸苦甘溫相合，化陰和血，濡養(yǎng)筋脈，其突出的功能就是舒攣止痛。中醫(yī)中將芍藥分為白芍和赤芍：白芍中醫(yī)主要治療頭暈、肢體痙攣、自汗和月經(jīng)不調(diào)等癥狀；赤芍主要用于清熱涼血、活血祛瘀等療效。此外，芍藥與其他中草藥復配使用，如芍藥甘草湯、八珍湯、芍藥甘草附子湯、當歸芍藥散等。據(jù)報道，芍藥苷對蜂毒引起痛覺具有明顯的緩解效果，對其引起的繼發(fā)性痛覺過敏，原發(fā)性痛覺過敏表現(xiàn)出明顯的治療效果，對抑制鏡像熱過敏的發(fā)生有明顯作用。研究表明，芍藥苷藥理作用主要具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥作用；抗血小板聚集作用；解痙作用；擴張血管作用和抗血栓形成的作用；抗炎、抗?jié)兒涂惯^敏的作用；調(diào)節(jié)免疫力作用等。因此，被世界許多國家廣泛用作中藥材和保健類食品。

目前，國內(nèi)外科研工作者在芍藥資源的遺傳多樣性、形態(tài)多樣化、起源與進化等方面做了大量研究工作。在形態(tài)、細胞、生理生化、葉綠體、抗性和分子標記開發(fā)等方面有深入研究，但對于芍藥種質(zhì)資源，尤其是野生種質(zhì)資源缺乏系統(tǒng)深入的研究。充分發(fā)掘華中地區(qū)芍藥種質(zhì)資源，培育專用型新品種，針對不同用途都要基于了解該區(qū)域芍藥的遺傳背景，但對于其起源、物種形成、分化等進化過程不清楚。本研究將基于SSR標記對華中地區(qū)芍藥種質(zhì)資源進行遺傳多樣性以及親緣關(guān)系的研究，從而為華中地區(qū)芍藥種質(zhì)資源的有效保護與開發(fā)利用提供參考，為芍藥重要性狀的分子育種和培育新品種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

芍藥種質(zhì)資源由河南省商丘醫(yī)學高等?？茖W校芍藥課題組于2017年分別在河南省、湖北省、安徽省等不同地區(qū)采集獲得(表1)，基本覆蓋了3省的芍藥主栽區(qū)域，本試驗在河南省商丘市虞城縣界溝鎮(zhèn)王橋村芍藥資源圃進行。

表2 引物信息

表1 材料來源

1.2 芍藥基因組DNA提取

利用改良的CTAB法提取各個芍藥資源總DNA，稱取0.5 g樣品進行提取總DNA。

1) 將CTAB 提取液置于65 ℃水浴鍋中預熱30 min。

2) 取0.5 g樣品加入液氮迅速研磨，加入2 mL預熱的CTAB提取液，置于65 ℃溫育30 min，每隔5～10 min顛倒混勻，然后冷至室溫。

3) 于12 000 r·min-1，4 ℃，離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管。

4) 加入等體積酚/氯仿(1∶1)，渦旋使其充分混勻，12 000 r·min-1離心15 min，取上清轉(zhuǎn)入另一新離心管。

5) 加入等體積氯仿，渦旋使其充分混勻，12 000 r·min-1，離心15 min，取上清轉(zhuǎn)入另一新離心管。

6) 重復步驟4)，5)1次。

7) 加入等體積的異丙醇混勻，室溫放置15 min，每隔5 min輕輕顛倒混勻。

8) 12 000 r·min-1，離心15 min，棄上清。

9) 將沉淀用70%的乙醇漂洗1次，12 000 r·min-1，離心10 min，棄上清，重復洗1次。

10) 倒掉廢液，12 000 r·min-1，4 ℃，空離心1 min。

11) 將沉淀用30μL TE溶解；

12) 取少量的DNA用于1%瓊脂糖凝膠電泳，OD值測量，檢測RNA的完整性和濃度，其余置于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR 擴增與檢測

1) PCR反應體系。

SSR引物體系(共20μL)：稀釋20倍模板DNA 2μL；10×Buffer 2μL；10 mmol·L-1dNTPs 0.4μL；5 U·μL-1Taq酶0.2μL；Eprimer 1μL (20μmol·L-1)；Mprimer 1μL (20μmol·L-1)(見表2)。

2) PCR反應采用如下循環(huán)參數(shù)。

SSR PCR擴增程序：混勻后于PCR儀上擴增，按以下程序擴增：95 ℃，5 min；95 ℃，35 s，65 ℃，35 s(每循環(huán)降低0.7 ℃)，72 ℃，1 min， 循環(huán)數(shù)為12個；94 ℃，30 s，56 ℃，30 s，72 ℃，1 min，循環(huán)數(shù)23個，72 ℃，5 min，反應結(jié)束后于4 ℃保存。

3) 引物信息。

從15對引物中篩選了8對引物進行批量SSR檢測。

每對引物的擴增產(chǎn)物隨機抽取樣品，取3μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將從測序儀上擴增得到的原始數(shù)據(jù)96個樣品、8對引物組合擴增產(chǎn)物利用GeneMarker 2.2軟件進行生物信息學分析，通過比較各泳道內(nèi)分子量內(nèi)標的位置與各樣品峰值的位置后，可以獲得大小不等的擴增片段信息。再根據(jù)條帶的有無轉(zhuǎn)化為0，1數(shù)據(jù)矩陣。通過對引物多態(tài)性的百分率與多態(tài)性信息指數(shù)(PIC)的計算，PIC=∑(1-pi2)/n，其中，pi為任一引物組合第i條多態(tài)性帶在所有供試材料中出現(xiàn)的頻率；n為供試材料的總數(shù)。利用popgene軟件和NTSYS軟件對樣品進行遺傳多樣性分析。利用POPGENE 32計算各個居群的多態(tài)位點百分比(PPL)；遺傳多樣性指數(shù)(Nei’s)；Shannon’s指數(shù)(Ⅰ)等；采用NTSYSpc 2.11軟件進行UPGMA聚類分析。

表3 100份芍藥試材SSR引物組合特征信息

圖1 基于Nei的遺傳距離的Neighbor-Joining聚類分析

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多態(tài)性分析

基于SSR技術(shù)對100份芍藥資源多態(tài)性進行評價，PCR擴增結(jié)果中平均每對引物擴增6條不同條帶，所有樣品共擴增出54條不同條帶。100份芍藥資源中平均有效等位基因位點數(shù)為6.75，其Shannon信息指數(shù)為1.174。觀察的100份資源雜合度為0.097 8(P 5)～0.989 6(P 55)，期望雜合度為0.209 5(P 5)～0.865 2(P 16)；100份芍藥資源中每對引物組合擴增條帶結(jié)果范圍為4～11條，其中，P 44可擴增出11條，為擴增帶數(shù)量最多的引物。而P 16引物的擴增出的結(jié)果的多態(tài)性指數(shù)最高，觀察擴增結(jié)果的雜合度為0.989 6，擴增芍藥資源的期望雜合度0.865 2，100份芍藥資源中有效等位基因位點數(shù)為7.174 1，其引物對100份芍藥資源的擴增Shannon信息指數(shù)2.132 6(見表3)。

2.2 芍藥遺傳相似系數(shù)與遺傳距離

100份芍藥種質(zhì)資源中，除去遺傳距離為0的材料，可能為同一個種質(zhì)，遺傳距離范圍在0.200 7～1.700 6之間，其中1與4兩份資源的遺傳距離最大，達到1.700 6；而8、11、20、21、22、24、25、28、32、33、52、75、76、78、79、82、84、85、87、89、91與9 722份資源以0.200 7達最小遺傳距離，說明為同一個資源。材料間相似系數(shù)(GS)變異除了0和1外，相似系數(shù)變異范圍為0.120 1～0.957 4之間，平均GS為0.538 6；芍藥資源20與132遺傳相似系數(shù)高達0.957 4，可能為同一份資源；從遺傳相似系數(shù)分析可見，芍藥種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)較小，說明芍藥種質(zhì)資源的遺傳變異較大(圖1)。

2.3 基于遺傳相似系數(shù)的芍藥種質(zhì)材料聚類分析

根據(jù)芍藥種質(zhì)材料間的遺傳相似系數(shù)，合并相同的資源對96份供試材料進行聚類分析(圖1)。當遺傳相似系數(shù)為0.488時，96份芍藥種質(zhì)資源在遺傳聚類上被分為3大類，其中104、105、106種質(zhì)資源為第Ⅰ類群；2、18、59和60為第Ⅱ類群；其他為第Ⅲ類群。第Ⅲ類群又分為Ⅲ-A、Ⅲ-B、Ⅲ-C亞類，其中Ⅲ-A亞類由資源4、6和17組成；Ⅲ-C亞類由資源1、26和69組成，其他資源共同組成Ⅲ-B亞類。在聚類圖中，96份芍藥資源為華北各地區(qū)的材料，從聚類圖中可以看出各地的資源存在著交互流通作用。

3 討 論

3.1 SSR分子標記與芍藥種質(zhì)資源的多樣性

本研究采用100種芍藥種質(zhì)資源，分別于河南、安徽、湖北收集與自育芍藥新材料，其各份資源間均具有代表性。說明在揭示芍藥種質(zhì)材料遺傳變異方面SSR標記效率較高。

隨著分子生物學的發(fā)展，目前國內(nèi)針對SSR標記芍藥遺傳多樣性分析的研究不多，可見對芍藥資源用SSR標記較RAPD標記具有一定高效性。

3.2 聚類分析在芍藥種質(zhì)資源遺傳多樣性評價的優(yōu)勢

本研究根據(jù)芍藥種質(zhì)資源間的相似系數(shù)對100份供試材料進行了聚類分析，結(jié)果表明，100份種質(zhì)的遺傳相似性系數(shù)值變異在0.120 1～0.957 4之間。實驗證明，使用聚類分析能有效揭示芍藥種質(zhì)間的親緣關(guān)系，更有利發(fā)現(xiàn)新的遺傳變異。

隨著芍藥產(chǎn)業(yè)的崛起，關(guān)于芍藥生物學研究也在逐年增多，利用分子標記開展對芍藥種質(zhì)資源的多樣性研究以及芍藥與牡丹等植物的親緣關(guān)系方面已有較為全面的研究，采用SSR標記不但能為芍藥資源收集、評價利用與保護提供重要的理論參考，還可以為分子標記輔助育種提供強有力的理論支撐。華中地區(qū)蘊含豐富的芍藥資源，具生態(tài)多樣性，本實驗樣品采集數(shù)量有限，應擴大芍藥居群的遺傳多樣性分析。綜上所述，采用SSR標記方法可為今后芍藥種質(zhì)資源創(chuàng)新利用和多樣性的研究提供更為準確的參考。