徐 浩，楊克彬，朱成磊，李 英，高志民

(國(guó)際竹藤中心，竹藤資源基因科學(xué)與基因產(chǎn)業(yè)化研究所，國(guó)家林業(yè)和草原局/北京市竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 100102)

竹子是我國(guó)最具價(jià)值的森林資源之一，在保障生態(tài)安全、木材安全等方面均發(fā)揮著重要作用。竹材優(yōu)良的材性，是由竹子生長(zhǎng)遺傳和環(huán)境共同決定的，不同竹種及同一竹種不同產(chǎn)地的竹材材性存在著較大差異[1-3]。雖然竹材材性不同程度地受到不同撫育墾復(fù)措施[4]、施肥[5-6]、鉤稍[7]等栽培措施的影響，但遺傳差異是決定材性的主要內(nèi)在因素。木質(zhì)素含量是影響木材材性的重要因素，木質(zhì)素生物合成涉及多種結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因和miRNA[8-10]。人們已經(jīng)從遺傳角度來(lái)研究竹子的材性特征，并開(kāi)始借助分子生物學(xué)手段研究竹材材性的生物合成調(diào)控，如參與竹子木質(zhì)素生物合成的基因CoCOMT[11]、PePAL1[12]、C4H[13]和PeLAC[14]等，參與纖維素合成的PeCesA1～7[15]，參與木聚糖合成的PeIRX9和PeIRX10[16]等。雖然對(duì)這些基因僅是初步研究，但對(duì)認(rèn)識(shí)竹子木質(zhì)素的生物合成以及竹材材性的遺傳調(diào)控分子機(jī)制具有重要意義。

肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)是木質(zhì)素合成的特異途徑中的關(guān)鍵酶之一，該酶以3種羥基桂酸的輔酶A酯(香豆酰輔酶A、阿魏酰輔酶A、芥子酰輔酶A)作為底物，催化生成相應(yīng)的肉桂醛，在木質(zhì)素生物合成中起主導(dǎo)作用[17]。關(guān)于CCR基因及其編碼蛋白的研究，已在擬南芥(Arabidopsis thalianaL.)、水稻(Oryza sativaL.)、小麥(Triticum aestivumL.)和玉米(Zea maysL.)等多種植物中開(kāi)展[18]；而對(duì)竹子CCR基因的研究?jī)H有2例報(bào)道，即從七彩紅竹(Indosasa hispidaM. cv. Rainbow)克隆了IhCCR-1[19]和從巴拉圭瓜多竹(Guadua paraguayanan)中得到了GpCCR基因，并研究了GpCCR在不同組織中的表達(dá)模式[20]。然而，對(duì)于竹子CCR基因功能研究尚未得到深入開(kāi)展。本研究以毛竹 (Phyllostachys edulis(Carrière) J. Houz.)為研究對(duì)象，克隆PeCCR基因，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)其在不同組織中以及不同高度筍中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，并利用在擬南芥異位表達(dá)的方法對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究，以期為揭示CCR基因在竹子木質(zhì)素生物合成中的功能以及對(duì)竹材材性形成的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以毛竹為對(duì)象，分別以實(shí)生苗(0.5 a)和野外毛竹為材料，其中，前者是用購(gòu)買自廣西桂林的毛竹種子在實(shí)驗(yàn)室條件下播種培養(yǎng)(培養(yǎng)基質(zhì)為腐殖土∶蛭石=6∶4，溫度≈25℃，光照強(qiáng)度≈300 μmol·m-2·s-1)的毛竹，取不同組織樣品用于基因表達(dá)組織特異性分析；后者是直接采取江西南昌 (28°45'58'' N，115°45'39'' E，海拔 399.0 m)野外生長(zhǎng)的毛竹，選取不同發(fā)育階段的竹筍(0.2、1.0、3.0、6.7 m)，取筍基部 (生根節(jié)的上部約 1 cm處切取竹壁，約1 cm×1 cm)為樣品，一部分用FAA固定液固定，用于切片觀察；另一部分用液氮淬凍處理后用干冰運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，存放于-80℃冰箱，用于RNA提取。

1.2 不同高度筍切片觀察

取上述經(jīng)FAA固定液固定的毛竹筍樣品，按照文獻(xiàn)[21]方法，用聚乙二醇( PEG)將材料固定，制作切片(厚度 10～15 μm)，用0.05%的甲苯胺藍(lán)O (TBO)染液染色后鏡檢觀察，拍照記錄。

1.3 RNA分離與cDNA的合成

將上述所取毛竹實(shí)生苗不同組織樣品和野外毛竹筍的樣品，在液氮中研磨成粉末，采用Trizol試劑，按照文獻(xiàn)[22]方法提取各樣品的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書(Promega公司)合成cDNA，存-20℃用于基因表達(dá)模式分析和克隆。

1.4 基因定量表達(dá)分析

根據(jù)毛竹CCR基因(PH01001334G0240)序列設(shè)計(jì)定量引物qPeCCR-F和qPeCCR-R(表1)。以毛竹PeNTB作為內(nèi)參基因[23]，分別以毛竹實(shí)生苗不同組織樣品和野外毛竹筍不同樣品的cDNA為模板，進(jìn)行PeCCR基因表達(dá)的定量分析。采用Roche Light Cycler?480 SYBR Green I Master試劑盒在耶拿公司QTower儀器上進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系 (10 μL)為：5.0 μL 的 2×SYBR Green I Mastermix，0.8 μL cDNA，正向引物和反向引物各 0.2 μL(10 μmol·L-1)，加 ddH2O 至反應(yīng)總體積為10.0 μL。 qPCR 程 序 ： 95℃10 min； 95℃ 10 s；60℃10 s；共 40 個(gè)循環(huán)。并應(yīng)用 2-△△Ct算法[24]分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外，利用前期本實(shí)驗(yàn)室毛竹葉、早花期花序、晚花期花序、地下莖、根、筍20 cm及筍50 cm等7個(gè)不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[25]，分析PeCCR在不同組織中的表達(dá)情況。

表 1 PCR擴(kuò)增所用引物Table 1 Primers used in PCR

1.5 基因克隆與載體構(gòu)建

根據(jù)PeCCR序列(PH01001334G0240)的編碼區(qū)序列和植物表達(dá)載體pC1301-35S-OCS[26]的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)基因克隆引物(PeCCR-F和PeCCR-R)和添加酶切位點(diǎn)(BamHⅠ和XbaⅠ)的載體構(gòu)建引物 (PeCCR-F1和 PeCCR-R1)(表 1)。以毛竹筍cDNA為模板，用PeCCR-F和PeCCR-R擴(kuò)增，獲得編碼區(qū)的片段。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后，以測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板用PeCCR-F1和PeCCR-R1擴(kuò)增，采用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切將PeCCR1連接到植物表達(dá)載體pC1301-35S-OCS的多克隆位點(diǎn)，形成植物過(guò)量表達(dá)載體。

1.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的篩選與分子鑒定

將過(guò)量表達(dá)載體pC1301-35S-PeCCR-OCS質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciensSmith &Townsend)菌株GV3101中，培養(yǎng)并獲得陽(yáng)性克隆菌株。經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證正確后，對(duì)單克隆陽(yáng)性菌株進(jìn)行培養(yǎng)，按照蘸花法[27]轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥(Col-0)，并收獲種子 (T0代)。用潮霉素 (Hyg,50 μg·mL-1)對(duì)T0代種子進(jìn)行篩選，獲得抗性植株并用PCR進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，繼續(xù)用潮霉素篩選至純合的轉(zhuǎn)基因植株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的材料。采用半定量RT-PCR方法驗(yàn)證在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)情況，同時(shí)以擬南AtUbiquitin(NM180850)為內(nèi)參基因[28]。

1.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型分析與木質(zhì)素含量測(cè)定

播種純合的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，直接觀察植株生長(zhǎng)的表型變化。取生長(zhǎng)6周的植株基部蓮座葉以上2 cm的擬南芥莖，用7%瓊脂固定后，進(jìn)行切片制作(厚度約40 μm)，經(jīng)用0.05%的TBO染色后制作臨時(shí)切片，觀察擬南芥莖中木質(zhì)素的情況。

另外，取基部蓮座葉以上3 cm的擬南芥莖，用溴乙酰法測(cè)定其中木質(zhì)素的含量，參照齊一生物科技(上海)有限公司的木質(zhì)素含量檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：QYS-237008)說(shuō)明書進(jìn)行，同時(shí)以同期的野生型擬南芥作為對(duì)照。按照以下公式計(jì)算木質(zhì)素含量（mg·g-1）：

式中：ΔA為測(cè)定管OD280值-空白管OD280值；V反總為反應(yīng)總體積2.04 mL；W為樣本質(zhì)量；T為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PeCCR克隆與分析

用引物 PeCCR-F和 PeCCR-R進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示：約在1.0 kb出現(xiàn)1條特異條帶，與預(yù)期目的基因大小一致，回收、克隆并送公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明：目的基因序列長(zhǎng)度為1 026 bp，序列與毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中PH01001334 G0240和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中毛竹cDNA(FP099901.1)的編碼區(qū)完全一致，命名為PeCCR。該基因編碼一個(gè)341 aa的蛋白，該蛋白包含肉桂酰輔酶A還原酶家族蛋白特有的保守結(jié)構(gòu)域“NWYCYAK”，以及植物CCR特有的NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)和識(shí)別區(qū)[17](圖 1)。

2.2 PeCCR基因的組織表達(dá)特異性分析

根據(jù)毛竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[28]中PH01001334G0240的RPKM值，分析發(fā)現(xiàn)：PeCCR在毛竹鞭、20 cm筍和50 cm筍中沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)，在根和葉中表達(dá)的RPKM值分別為2.380 64和1.832 46。由此表明，在不同組織中的表達(dá)存在明顯差異。利用qRT-PCR方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室毛竹實(shí)生苗不同組織中PeCCR的基因表達(dá)分析表明：PeCCR在各個(gè)組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量差異明顯，其中，在莖中的表達(dá)最低，根中表達(dá)量最高，其次是筍芽和葉片，在葉鞘和未展開(kāi)葉中的表達(dá)量比較相近且相對(duì)較低(圖2)。這與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)PeCCR在根中的RPKM值最高相一致，但不同于筍中沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)。

2.3 竹筍木質(zhì)化程度與PeCCR表達(dá)分析

對(duì)毛竹筍樣品的TBO染色鏡檢觀察表明：隨著毛竹筍高度的增加，維管束的染色加深區(qū)域明顯逐漸擴(kuò)大，尤其是厚壁細(xì)胞顏色明顯逐漸加深，表明筍的木質(zhì)化程度逐漸加強(qiáng)(圖3)。筆者推測(cè)PeCCR的表達(dá)與竹子的木質(zhì)化有關(guān)，參與木質(zhì)素的生物合成，為此，對(duì)PeCCR在不同高度筍中的表達(dá)進(jìn)行了定量分析。結(jié)果（圖4）表明：PeCCR在0.2 m筍中的表達(dá)量相對(duì)較低，在1.0 m筍中迅速上升(約是0.2 m筍中的16倍)，3.0 m筍中基本保持1.0 m筍中的水平，而6.7 m筍中PeCCR的表達(dá)量又有所上升，約是0.2 m筍中的18倍。由此表明，PeCCR基因的表達(dá)隨著筍高度的增加呈上升趨勢(shì)，這與竹筍的木質(zhì)化程度逐漸加深相一致。

圖 1 PeCCR的核酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of PeCCR

2.4 PeCCR載體構(gòu)建與驗(yàn)證

以測(cè)序正確的PeCCR質(zhì)粒為模板，用PeCCRF1和PeCCR-R1擴(kuò)增的結(jié)果表明，獲得了預(yù)期目的片段(圖略)?；厥铡⒖寺〔⑺凸緶y(cè)序表明，目的片段包含了酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XbaⅠ序列及PeCCR的編碼區(qū)序列。采用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切將PeCCR連接到植物表達(dá)載體，形成過(guò)量表達(dá)載體 pC1301-35S-PeCCR-OCS(圖 5A)，質(zhì)粒酶切(圖5B)進(jìn)一步證明獲得了正確的PeCCR植物過(guò)量表達(dá)載體。

2.5 轉(zhuǎn)PeCCR擬南芥檢測(cè)與表型分析

將pC1301-35S-PeCCR-OCS質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，并轉(zhuǎn)化擬南芥。對(duì)獲得的純合株系表型分析發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，轉(zhuǎn)PeCCR基因植株葉片明顯增大，且抽苔時(shí)間提前3～4 d，由此表明：過(guò)量表達(dá)PeCCR促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)發(fā)育。利用RT-PCR對(duì)獲得轉(zhuǎn)基因植株中PeCCR表達(dá)進(jìn)行了半定量分析，電泳結(jié)果（圖6）顯示：在2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中均檢測(cè)到PeCCR基因表達(dá)，而野生型擬南芥中未檢測(cè)到PeCCR基因表達(dá)，且2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(Line1和Line2)中PeCCR基因的表達(dá)量不同，轉(zhuǎn)基因株系Line1中的表達(dá)量高于Line2。

圖 2 PeCCR在毛竹不同組織中表達(dá)分析Fig. 2 Expression analysis of PeCCR in different tissues of moso bamboo

圖 3 毛竹不同高度筍維管束的橫切面Fig. 3 Transverse sections of vascular bundle in bamboo shoot with different heights.

圖 4 PeCCR在毛竹不同高度筍中表達(dá)分析Fig. 4 Expression analysis of PeCCR in bamboo shoots with different heights

圖 5 PeCCR過(guò)量表達(dá)載體(A)及其酶切檢測(cè)(B)Fig. 5 Overexpression vector of PeCCR (A) and its detection with enzyme digestion (B)

莖的橫切組織化學(xué)染色觀察顯示：轉(zhuǎn)PeCCR基因植株中木質(zhì)部和束間纖維組織的染色面積均大于野生型(圖7)，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株莖中的木質(zhì)素多于野生型植株。采用乙酸-溴乙酰法對(duì)PeCCR1轉(zhuǎn)基因株系木質(zhì)素含量測(cè)定結(jié)果（圖8）表明：2個(gè)過(guò)表達(dá)PeCCR轉(zhuǎn)基因株系中的木質(zhì)素含量均明顯高于野生型，L1和L2分別為對(duì)照的123.1%和116.7%，且L1高于L2，這與組織化學(xué)染色法取得的結(jié)果相一致，也和2個(gè)株系中PeCCR的表達(dá)量相一致。由此表明，過(guò)表達(dá)PeCCR基因促進(jìn)木質(zhì)素的生物合成，木質(zhì)素含量增加達(dá)到顯著性水平(p＜0.01)。

3 討論

圖 6 轉(zhuǎn)基因植株中PeCCR基因表達(dá)的分析Fig. 6 Gene expression analysis of PeCCR1in transgenic plants

圖 7 擬南芥莖橫切面Fig. 7 Transverse sections of Arabidopsis stem overexpressing PeCCR

圖 8 過(guò)量表達(dá)PeCCR擬南芥莖木質(zhì)素含量分析Fig. 8 Lignin content analysis of Arabidopsis stem overexpressing PeCCR

目前，木材安全已經(jīng)上升到我國(guó)國(guó)家戰(zhàn)略的高度，隨著天然林保護(hù)政策的實(shí)施，木材供給不足的問(wèn)題日益突出。竹材已成為木材資源的重要替代品，有效緩解了木材的供需矛盾，在我國(guó)區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生態(tài)保護(hù)當(dāng)中都發(fā)揮著不可替代的作用。研究竹材形成的分子機(jī)制，對(duì)于未來(lái)竹子的分子育種具有重要價(jià)值。毛竹基因組草圖的發(fā)表與數(shù)據(jù)應(yīng)用[25,29]，為從毛竹中克隆目的基因，研究其功能提供了方便。本研究克隆了木質(zhì)素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因PeCCR，其編碼蛋白長(zhǎng)度(341 aa)比七彩紅竹的IhCCR-1 (345 aa)和巴拉圭瓜多竹(354 aa)略短，但都含有CCR家族特有的蛋白保守結(jié)構(gòu)域，是CCR家族成員之一。毛竹CCR家族包含17個(gè)成員[30]，在基于毛竹、水稻和擬南芥CCR氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，毛竹各CCR成員均與單子葉植物水稻聚類到較近的位置，而與擬南芥的距離相對(duì)較遠(yuǎn)(圖略)，這與前期研究相一致[31]，且PeCCR與水稻的OsCCR4 (OS09G04050)聚類在一起，二者的蛋白相似系數(shù)為88.2%，而OsCCR4是功能性CCR的候選者[32]，表明PeCCR與OsCCR4可能具有相似的功能。

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的表達(dá)譜和實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果都表明，PeCCR在毛竹根中的表達(dá)豐度最高，與小麥的Ta-CCR2(AY771357.1)在根中表達(dá)豐富[33]相類似。切片組織化學(xué)染色結(jié)果表明，毛竹筍的木質(zhì)化程度隨著筍高度的增加而不斷加強(qiáng)，且其中PeCCR的基因表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，這與小麥處于木質(zhì)化的根中Ta-CCR2高表達(dá)相一致[33]。研究表明，體外重組Ta-CCR2蛋白對(duì)阿魏酰CoA、5-OH-阿魏酰CoA、芥子酰CoA和咖啡酰CoA具有幾乎相似的轉(zhuǎn)化效率，表明它參與愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(guaiacyllignin, G型木質(zhì)素)和紫丁香基木質(zhì)素(syringyllignin, S型木質(zhì)素)合成[33]。PeCCR與Ta-CCR2的氨基酸序(AAX08107.1)一致性為87.1%。在擬南芥中過(guò)量表達(dá)PeCCR，促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)發(fā)育和開(kāi)花提前，顯著提高其莖中木質(zhì)素含量，進(jìn)一步表明具有參與木質(zhì)素生物合成的功能。另外，研究表明，CCR基因還能通過(guò)影響微纖夾角來(lái)影響木材材質(zhì)的密度和硬度[34]。由此表明，毛竹材性形成過(guò)程中，PeCCR可能是通過(guò)參與調(diào)控木質(zhì)素含量、木質(zhì)素單體比例等多個(gè)方面來(lái)影響其材性的，但其在毛竹中的具體功能有待于深入研究。

4 結(jié) 論

本研究從毛竹克隆了PeCCR基因，用RTPCT技術(shù)證明該基因在毛竹實(shí)生苗不同組織中存在表達(dá)差異；在野外隨竹筍高度的增加，木質(zhì)化程度加強(qiáng)，PeCCR基因表達(dá)量上調(diào)；在擬南芥中過(guò)量表達(dá)PeCCR，促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)發(fā)育，開(kāi)花提早，木質(zhì)素含量增加。本研究對(duì)于深入研究竹子木質(zhì)素合成調(diào)控與竹材材性形成機(jī)制具有重要參考價(jià)值。