張?jiān)魄?孟祥龍,范廣宇,馬桂珍,唐 秀,李配婷

(1. 江蘇海洋大學(xué), 江蘇 連云港 222051; 2. 連云港海關(guān), 江蘇 連云港 222042)

近年來(lái),隨著生活水平的不斷提高,人們對(duì)日常食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的認(rèn)識(shí)不斷深入,水產(chǎn)品因富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì),在人們的飲食結(jié)構(gòu)中占據(jù)著重要地位。但是在漁業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中,常采用三唑磷、氯氰菊酯、溴氰菊酯等殺蟲劑作為清塘劑來(lái)殺死雜魚,保護(hù)貝類種苗,清除有害生物等[1,2],這些農(nóng)藥對(duì)水產(chǎn)品毒性較大,常引起漁業(yè)污染事故,具有潛在的農(nóng)藥殘留生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[3]。本課題組[4]在前期研究中發(fā)現(xiàn)貝類產(chǎn)品中有毒死蜱、撲草凈、西瑪津等農(nóng)藥殘留,另外,國(guó)內(nèi)外也有研究[5-7]發(fā)現(xiàn)敵敵畏、氰戊菊酯、滴滴涕等有機(jī)氯類、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留于水體環(huán)境中,這些農(nóng)藥可能通過(guò)食物鏈富集到人體內(nèi),危害人類健康。因此,建立一種快速、準(zhǔn)確地篩查水產(chǎn)品多種農(nóng)藥殘留的方法具有重要意義。

農(nóng)藥殘留的分析方法主要有氣相色譜法[8]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2]。氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在同時(shí)定性定量方面比氣相色譜有明顯優(yōu)勢(shì)。水產(chǎn)品中含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪、類固醇類等化合物,易造成儀器污染,干擾目標(biāo)農(nóng)藥的檢測(cè)[10]。因此,建立良好的前處理方法是關(guān)鍵。常見的水產(chǎn)品萃取方法有固相萃取法[11]、QuEChERS法[1]、凝膠滲透色譜法[12]等,而加速溶劑同步萃取凈化法不僅具有加速溶劑萃取法萃取效率高、重復(fù)性好、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)[12-17],同時(shí)能省去凈化步驟,縮短前處理時(shí)間。目前該方法主要用于土壤及沉積物基質(zhì)中多氯聯(lián)苯、多氯烴類以及水產(chǎn)品中的有機(jī)磷阻燃劑類的檢測(cè)[18-20],但未發(fā)現(xiàn)將加速溶劑同步萃取凈化法用于水產(chǎn)品中多農(nóng)藥殘留檢測(cè)的報(bào)道。因此,本文建立了加速溶劑同步萃取凈化-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定貝類中多種農(nóng)藥殘留快速篩選、確證及定量的系統(tǒng)分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TSQ 8000氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有三重四極桿檢測(cè)器和Trance Finder 3.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))、ASE350加速溶劑萃取儀(配有22 mL不銹鋼萃取池)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司); N-EVAP TM型氮?dú)獯蹈蓛x(美國(guó)Organomation Associates公司)。

64種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(見表1):撲草凈、西草凈、戊草凈、銳勁特、惡草酮、禾草靈、腈菌唑固體農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于97%)購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司,其余57種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(100 μg/mL)購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。乙腈、丙酮均為色譜純(德國(guó)Merck公司);N-丙基乙二胺(PSA)和石墨化炭黑(GCB)(美國(guó)Agilent公司);實(shí)驗(yàn)用水均為超純水;氯化鈉為優(yōu)級(jí)純(中國(guó)國(guó)藥試劑公司);樣品采自附近水產(chǎn)養(yǎng)殖基地。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取固體標(biāo)準(zhǔn)品,置于棕色容量瓶中,用丙酮準(zhǔn)確定容,配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置于-18 ℃冰箱中保存,備用。分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,逐級(jí)稀釋后得質(zhì)量濃度均為1 mg/L的64種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置于-18 ℃冰箱中保存,備用。使用前將64種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液恢復(fù)至室溫,并用乙腈稀釋至所需濃度,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

稱取制備好的空白文蛤基質(zhì)5.0 g,置于研缽中,加適量硅藻土,研磨均勻后,轉(zhuǎn)入22 mL萃取池中(底部已添加0.8 g PSA和0.8 g GCB)。萃取溶劑為90%(v/v)乙腈水溶液,萃取溫度85 ℃,沖洗體積60%萃取池體積,循環(huán)1次。加速溶劑萃取后,萃取液中加入5.0 g氯化鈉粉末,進(jìn)行搖勻振蕩,離心,取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,用乙腈定容至1.0 mL,以3 500 r/min離心5 min,過(guò)0.22 μm濾膜,待GC-MS/MS測(cè)定。

1.4 儀器條件

色譜柱:HP-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度:250 ℃;進(jìn)樣模式:不分流進(jìn)樣;載氣:高純氦氣;流速:1.0 mL/min;升溫程序:初始溫度50 ℃,保持1 min,以20 ℃/min的速率升至150 ℃,以3 ℃/min的速率升至230 ℃,再以10 ℃/min的速率升至290 ℃,保持3 min;進(jìn)樣量:1 μL。

離子源:EI源;離子源溫度:250 ℃;傳輸線溫度:290 ℃;發(fā)射電流:50 μA;分析模式:MRM模式;碰撞氣(Ar)壓力:0.159 6 Pa。64種農(nóng)藥的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 64種農(nóng)藥的保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子對(duì)和碰撞能量(CE)

表 1 (續(xù))

* Parent ion.

圖 1 不同體積分?jǐn)?shù)的乙腈水溶液對(duì)64種農(nóng)藥萃取效率的影響Fig. 1 Effects of the different volumes of acetonitrile aqueous solution on the recoveries of the 64 pesticides

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的優(yōu)化

據(jù)相關(guān)研究[21]發(fā)現(xiàn),由于水產(chǎn)品富含蛋白質(zhì)基質(zhì),使用乙腈水溶液溫和提取農(nóng)藥,效率更高。因此實(shí)驗(yàn)分別研究了純乙腈,以及體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%、90%乙腈的水溶液作為提取溶劑時(shí)的提取效率(見圖1)。結(jié)果表明,隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的不同,目標(biāo)分析物的回收率受到明顯影響。使用純乙腈時(shí),回收率在70%～120%之間的目標(biāo)分析物僅有47個(gè),數(shù)量最少,并且在此梯度提取條件下,有12個(gè)目標(biāo)分析物回收率低于70%,主要為有機(jī)磷類化合物。可能是使用純乙腈時(shí),蛋白質(zhì)變性速率過(guò)快,聚集沉淀,包裹這些藥物,導(dǎo)致化合物回收率偏低。在使用90%乙腈水溶液作為提取溶劑時(shí),目標(biāo)分析物回收率在70%～120%之間的數(shù)量最多,僅有氟氰戊菊酯、氯菊酯、甲基對(duì)硫磷的回收率高于120%。提取溶劑為70%乙腈水溶液時(shí),回收率小于70%的8個(gè)目標(biāo)分析物主要也是以上幾種有機(jī)磷化合物,說(shuō)明有機(jī)磷化合物受親水作用影響較明顯,可能蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑水溶液中的變性程度相較于純有機(jī)溶劑更加完全[22]。當(dāng)乙腈的體積分?jǐn)?shù)低于70%時(shí),蛋白質(zhì)不能完全變性,無(wú)法與這些藥物分離完全。因此,綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)選擇90%乙腈水溶液作為最佳提取溶劑。

2.2 加速溶劑萃取其他參數(shù)的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)除了考察萃取溶劑外,還考察了其他影響加速溶劑萃取效率的因素,包括萃取溫度(65、85和105 ℃)、循環(huán)次數(shù)(1、2和3次)和沖洗體積參數(shù)(60%、80%和100%)(見圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著萃取溫度的升高，目標(biāo)分析物的回收率也逐漸增加,但基本上在70%～120%之間,但當(dāng)萃取溫度為105 ℃時(shí),敵敵畏、甲胺磷的回收率降低,低于70%,可能由于溫度的升高,這兩種化合物對(duì)熱不穩(wěn)定而分解,且隨著溫度的升高,共萃取物含量更多,不利于后續(xù)凈化過(guò)程。綜合考慮選取85 ℃為萃取最適溫度。

如圖2所示,發(fā)現(xiàn)沖洗體積為60%萃取池體積時(shí),目標(biāo)農(nóng)藥的回收率基本在70%～80%之間;而40%時(shí)回收率低于70%的農(nóng)藥偏多,可能由于沖洗體積較少,提取溶劑未能充分接觸基質(zhì)樣品,部分農(nóng)藥提取不充分,導(dǎo)致回收率偏低;當(dāng)為80%時(shí),部分農(nóng)藥回收率大于110%,可能隨著沖洗體增加,共萃取物增多,導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)的增強(qiáng)。綜合考慮選取沖洗體積為60%萃取池體積。

圖 2 萃取溫度、萃取池沖洗體積分?jǐn)?shù)、循環(huán)次數(shù)對(duì)64種目標(biāo)農(nóng)藥回收率影響Fig. 2 Effect of extraction temperatures, flush volume fractions of the pool volume and numbers of cycles on the recoveries of the 64 target pesticides

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),萃取過(guò)程中循環(huán)次數(shù)的不同，農(nóng)藥的回收率基本均高于80%,但隨著次數(shù)的增加,回收率高于110%的農(nóng)藥也增多,可能隨著次數(shù)增加,共萃取物增多,基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng),同時(shí),考慮到溶劑對(duì)環(huán)境的污染,最終選取循環(huán)次數(shù)為1次。

2.3 凈化材料的優(yōu)化

未添加凈化材料時(shí),提取液經(jīng)GC-MS/MS測(cè)定后,通過(guò)觀察全掃描色譜圖,并結(jié)合NIST譜庫(kù)定性,較大的干擾峰主要分布于8～22 min(脂肪酸色譜峰)和34～40 min(膽固醇色譜峰)之間。因此需要對(duì)樣品進(jìn)行凈化,采用較多的凈化材料為PSA和GCB[1,23]。本實(shí)驗(yàn)考察了PSA(0.2、0.4、0.6、0.8、1.2和1.4 g)和GCB(0.4、0.6、0.8和1.2 g)的用量對(duì)凈化效果的影響。

未添GCB時(shí),考察了PSA用量(0.2、0.4、0.6、0.8、1.2和1.4 g)對(duì)凈化效果和萃取效率的影響。如圖3a所示,當(dāng)PSA添加量為0.8 g時(shí),脂肪酸的峰面積明顯減小,回收率基本在70%～120%之間,但當(dāng)添加量達(dá)到1.2 g時(shí),脂肪酸干擾峰基本被消除,但是大多數(shù)有機(jī)磷類目標(biāo)分析物回收率低于70%。因此,PSA最適添加量選為0.8 g。

PSA添加量為0.8 g時(shí),考察了GCB不同添加量(0.4、0.6、0.8和1.2 g)的凈化效果和萃取效率。如圖3b所示,當(dāng)GCB添加量達(dá)到0.8 g時(shí),膽固醇干擾峰明顯減小,提取液顏色也呈無(wú)色透明狀態(tài),同時(shí)目標(biāo)分析物回收率也在70%～120%之間;當(dāng)添加量為1.2 g時(shí),六氯苯、敵敵畏、甲胺磷等目標(biāo)分析物的回收低于50%。綜合考慮,GCB添加量為0.8 g。

圖 3 (a)PSA和(b)GCB不同添加量下提取液的全掃描色譜圖Fig. 3 Full scan chromatograms of extracts at different amounts of PSA and GCB PSA: primary secondary amine; GCB: graphitized carbon black.

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

分析方法的驗(yàn)證根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27417-2017要求進(jìn)行評(píng)估,方法確認(rèn)參數(shù)包括方法檢出限(MDL)、定量限、線性關(guān)系、準(zhǔn)確度、精密度和基質(zhì)效應(yīng)(ME)。

2.4.1線性關(guān)系和MDL

配制質(zhì)量濃度為10.0、20.0、50.0、100.0、400.0和1 000.0 μg/L的64種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以峰面積(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x, μg/L)進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,得到的線性回歸方程和決定系數(shù)(r2)見表2。

根據(jù)《環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168-2010)方法及其計(jì)算公式MDL=S×t(n-1, 1-α=0.99)計(jì)算方法檢出限。其中,n=重復(fù)測(cè)定的加標(biāo)樣品數(shù),S=n次加標(biāo)測(cè)定濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差,t=自由度為n-1時(shí)的Student’st值(可查表得到); 1-α為置信水平。以3～5倍MDL值對(duì)應(yīng)的濃度定義方法的定量限(見表2)。

在線性范圍10.0～1 000 μg/L內(nèi),64種農(nóng)藥的決定系數(shù)在0.989以上,線性良好;方法檢出限為0.7～3.3 μg/kg,定量限為2.0～10.0 μg/kg,顯示具有較高的靈敏度。

表 2 64種農(nóng)藥的決定系數(shù)、方法檢出限、定量限、基質(zhì)效應(yīng)、回收率和精密度(n=6)

表 2 (續(xù))

-: pesticides were not spiked at this level.

2.4.2基質(zhì)效應(yīng)

為了考察基質(zhì)效應(yīng)的影響,對(duì)文蛤空白樣品按照1.3節(jié)方法處理,得到空白基質(zhì)液,按照10.0、20.0、50.0、100.0、400.0和1 000.0 μg/L濃度梯度配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,同時(shí)用乙腈試劑配制相同系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照公式進(jìn)行計(jì)算:ME=[(基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率)-1]×100%。|ME|<20%為弱基質(zhì)效應(yīng),20%≤|ME|≤50%為中等基質(zhì)效應(yīng),|ME|>50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。

根據(jù)表2可知,46.9%的化合物表現(xiàn)出基質(zhì)抑制效應(yīng)(ME<0),而51.6%的化合物表現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)(ME>0)。47%的化合物的基質(zhì)效應(yīng)(-20%

2.4.3回收率和精密度

采用空白文蛤樣品,按照1.3節(jié)前處理方法處理后,分別對(duì)64種農(nóng)藥進(jìn)行2.0、5.0、10.0和100.0 μg/kg 4個(gè)水平的添加回收試驗(yàn),每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次,得到方法的回收率和精密度見表2。結(jié)果表明,64種農(nóng)藥的平均回收率為69.4%～129.7%,精密度為0.7%～16.0%(n=6),均滿足基本要求。

綜合以上結(jié)果,所開發(fā)的方法靈敏度高,穩(wěn)定性強(qiáng),重復(fù)性好,能滿足標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27417-2017評(píng)估參數(shù)要求,適用于貝類水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

除了進(jìn)行方法驗(yàn)證外,還將該方法應(yīng)用于33批次貝類樣品(文蛤8批次、扇貝11批次和河蜆14批次)檢測(cè),僅檢出2種高于定量限的農(nóng)藥。滴滴涕最高殘留量為30.3 μg/kg,毒死蜱最高殘留量為18.9 μg/kg,其余農(nóng)藥均為低于定量限或未檢出。最新的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[24]中針對(duì)水產(chǎn)品做出限量要求的只有六六六和滴滴涕,分別為0.1 mg/kg和0.5 mg/kg,其余農(nóng)藥殘留沒有制定限量要求,國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)、歐盟和美國(guó)等組織、國(guó)家和地區(qū)也沒有相關(guān)的限量要求,但根據(jù)日本一律標(biāo)準(zhǔn)0.01 mg/kg的限量要求[25],貝類產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)較高,因而需要進(jìn)一步研究來(lái)評(píng)估潛在的風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)加速溶劑萃取溶劑、萃取溫度、循環(huán)次數(shù),以及凈化材料的優(yōu)化,建立了加速溶劑同步萃取凈化-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定貝類中64種農(nóng)藥殘留的方法。實(shí)際檢測(cè)結(jié)果表明,該方法樣品提取和凈化同步完成,減少了凈化步驟,提取效率高,自動(dòng)化程度高,重復(fù)性好,靈敏度高,能夠?yàn)樨愵愃a(chǎn)品中多種農(nóng)藥殘留的痕量監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。