岑建斌,梁志森,區(qū)碩俊,黃嘉樂,李秀英,林青蘭,陳玉珍,劉炘杰,林森煜

(廣州檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)有限公司, 國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心, 廣東 廣州 511447)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人們生活得到改善,越發(fā)關(guān)注自身健康,因此保健品的需求不斷擴(kuò)大。各類添加植物提取物的保健品備受消費(fèi)者青睞。特別是黃芩被大量使用到保健品片劑中。野黃芩素(scutellarein)、4′-羥基漢黃芩素(4′-hydroxywogonin)、去甲漢黃芩素(norwogonin)、黃芩素(baicalein)和漢黃芩素(wogonin)是黃芩等植物提取物的主要活性成分,它們具有護(hù)肝[1]、抗氧化[2]、抗糖尿病[3]、抗炎、保護(hù)神經(jīng)[4]、抗纖維化[5]、抗病毒[6]、抗癌[7]等作用。

除了黃芩植物外,5種黃芩素還存在于多種植物中,不同草藥對(duì)成品有帶入作用。加之不同企業(yè)有不同的添加標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)因?yàn)榛旌霞夹g(shù)、加工過程、質(zhì)量控制等因素影響,易造成黃芩素?fù)p失或過量添加,黃芩素類物質(zhì)含量在不同產(chǎn)品間差別很大。由于過量攝入相關(guān)成分對(duì)人體的危害尚未明確,這些產(chǎn)品可能會(huì)為人們帶來潛在健康風(fēng)險(xiǎn),因而對(duì)黃芩素含量的測(cè)定對(duì)保健品價(jià)值的評(píng)價(jià)具有重要意義。目前,針對(duì)黃芩素類物質(zhì)的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[8-11]、毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)-電化學(xué)檢測(cè)法[12,13]、大氣壓采樣高分辨質(zhì)譜法[14]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[15-17]、HPLC-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜法[18],這些分析方法的研究目前主要集中在草藥及血清成分分析方面,針對(duì)保健品片劑的定性定量研究鮮有報(bào)道。其中,HPLC及CZE-電化學(xué)檢測(cè)法靈敏度較低,對(duì)樣品富集要求較高。大氣壓采樣高分辨質(zhì)譜法及HPLC-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜法雖然靈敏度高,但定量效果較三重四極桿質(zhì)譜差,而且儀器價(jià)格高昂,方法較難普及。HPLC-MS/MS則具有靈敏度高,定量準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn),對(duì)于容易受樣品基質(zhì)干擾的化合物,具有更好的分析能力。在前處理方面,主要有固相萃取法[16,19]和分散液液萃取法[18,20]等。固相萃取法操作復(fù)雜,操作時(shí)間較長(zhǎng),分散液液萃取法需要使用大量有機(jī)溶劑萃取且無有效的凈化措施,當(dāng)目標(biāo)物存在干擾時(shí)無有效解決措施。分散固相萃取技術(shù)結(jié)合液液萃取和固相萃取的原理,利用吸附劑吸附雜質(zhì),溶劑用量少,具備環(huán)保,靈敏度高,高效快速等優(yōu)點(diǎn)[21,22],適用于保健品片劑中5種黃芩素的提取凈化。本文采用分散固相萃取技術(shù)結(jié)合HPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)保健品片劑中的5種黃芩素(結(jié)構(gòu)見圖1)進(jìn)行測(cè)定,所建立的分析方法操作簡(jiǎn)便快速,回收率高,重現(xiàn)性好,適用于實(shí)驗(yàn)室的日常分析測(cè)定。

CompoundR1R2R3ScutellareinHOHOH4′-HydroxywogoninOCH3HOHNorwogoninOHHHBaicaleinHOHHWogoninOCH3HH圖 1 5種黃芩素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of the five baicaleins

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Scientific U3000超高效液相色譜儀, Thermo Scientific TSQ Endura三重四極桿質(zhì)譜儀(配有電噴霧(H-ESI)離子源)(美國(guó)Thermo Scientific公司);Genius NM32LA氮?dú)獍l(fā)生器(英國(guó)Peak Scientific Instruments公司); 3K15高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司); KDC-40低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司); Multi Reax混勻振蕩器(德國(guó)Heidolph公司); ML204T電子天平(瑞士Mettler Toledo公司); Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

野黃芩素(CAS No. 529-53-3,純度98.5%,上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司); 4′-羥基漢黃芩素(CAS No. 57096-02-3,純度≥98%)、去甲漢黃芩素(CAS No. 4443-09-8,純度≥98%)、漢黃芩素(CAS No. 632-85-9,純度≥98%),均購自武漢天植生物技術(shù)有限公司;黃芩素(CAS No. 491-67-8,純度≥98%,上海源葉生物科技有限公司)。

乙腈、丙酮、乙酸乙酯均為HPLC級(jí)(德國(guó)Merck公司);甲酸為分析純級(jí)(美國(guó)Sigma Aldrich公司);二甲亞砜、氯化鈉均為分析純級(jí)(廣州化學(xué)試劑廠); C18凈化填料和石墨化炭黑(GCB)購自上海安譜實(shí)驗(yàn)室科技股份有限公司;乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)購自美國(guó)Supelco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品前處理

取保健品片劑20 g,粉碎,混合均勻,稱取1.0 g(精確至0.001 g)樣品于50 mL離心管中,準(zhǔn)確加入5 mL水和10 mL丙酮,渦旋振蕩提取10 min,加入5 g氯化鈉,渦旋混合均勻30 s, 4 000 r/min離心2 min,取1 mL上清液轉(zhuǎn)移至裝有75 mg C18吸附劑的高速離心管中,渦旋1 min, 10 000 r/min高速離心2 min,上清液過0.22 μm尼龍膜,待測(cè)。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用甲醇溶解黃芩素、漢黃芩素,用二甲亞砜溶解野黃芩素、4′-羥基漢黃芩素、去甲漢黃芩素,分別配制成1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃保存。分別取100 μL和10 μL儲(chǔ)備液至同一容量瓶中,用丙酮定容至10 mL,配制得到10 mg/L和1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

使用壓片糖果空白基質(zhì)溶液配制基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3液相色譜條件

色譜柱:Thermo Scientific Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm,美國(guó)Thermo Scientific公司);流動(dòng)相:A為0.1%(v/v)甲酸乙腈;B為0.1%(v/v)甲酸水。梯度洗脫:0～4.0 min, 90%B; 4.0～15.0 min, 90%B～45%B; 15.0～15.5 min, 45%B～90%B; 15.5～18 min, 90%B。流速:0.3 mL/min;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:5 μL。

1.2.4質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(H-ESI);正離子模式;離子源電壓:3 500 V;碰撞氣:高純氬氣(純度>99.999%);鞘氣: 4.58 L/min;輔助氣: 8.85 L/min;吹掃氣: 0 L/min;離子傳輸管溫度: 330 ℃;蒸發(fā)溫度: 330 ℃;選擇離子反應(yīng)掃描模式(selective reaction monitoring, SRM);質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。測(cè)量數(shù)據(jù)采用賽默飛TraceFinder Software 3.0(美國(guó)Thermo Scientific公司)進(jìn)行采集和處理。

表 1 5種目標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過對(duì)黃芩素類化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)5種黃芩素均含有羥基和羰基,黃芩素類化合物在ESI離子源正負(fù)模式電離時(shí),均可以形成[M+H]+和[M-H]-的分子離子峰。因此在電噴霧正、負(fù)模式下,以流動(dòng)注射的方式分別對(duì)5種化合物進(jìn)行質(zhì)譜掃描,發(fā)現(xiàn)5種分析物在正模式下的響應(yīng)均比其在負(fù)模式下高。通過進(jìn)一步優(yōu)化射頻電壓(RF Lens)和碰撞電壓,每個(gè)目標(biāo)化合物選取2對(duì)響應(yīng)最強(qiáng)的特征離子作為定性離子,其中響應(yīng)最高的用于定量分析。

對(duì)比了Atlantis T3色譜柱與2種不同品牌的常規(guī)C18色譜柱共3種相同規(guī)格色譜柱的分離效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,使用Atlantis T3柱分離,去甲漢黃芩素與黃芩素這兩種同分異構(gòu)體物質(zhì)的色譜峰部分重合,這是由于它采用三官能團(tuán)C18烷基鍵合相,對(duì)極性化合物分離有較大優(yōu)勢(shì),但5種黃芩素均為中等極性化合物,因此分離效果不理想;Eclipseplus C18對(duì)去甲漢黃芩素和黃芩素兩種化合物分離效果不佳;使用Hypersil GOLD柱的分離效果較好,目標(biāo)物的提取色譜圖見圖2,其中5種目標(biāo)物均可達(dá)到基線分離。綜上,本實(shí)驗(yàn)選用Hypersil GOLD柱。

圖 4 不同丙酮用量對(duì)5種分析物平均回收率的影響(n=6)Fig. 4 Effect of different dosages of acetone on average recoveries of the five analytes (n=6)

圖 2 5種目標(biāo)物在Hypersil GOLD柱上的提取離子流色譜圖Fig. 2 Extracted ion chromatograms of the five analytes on Hypersil GOLD column

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑種類的優(yōu)化

圖 3 不同提取溶劑對(duì)5種目標(biāo)物平均回收率的影響(n=6)Fig. 3 Effect of different extract solvents on average recoveries of the five analytes (n=6)

研究表明,極端pH、加熱等條件會(huì)令黃酮類物質(zhì)分解[23,24],黃芩素類化合物屬于黃酮類化合物。針對(duì)黃芩素類化合物的這類特性,宜采用渦旋振蕩的方式進(jìn)行提取。以下優(yōu)化實(shí)驗(yàn)選取基質(zhì)效應(yīng)較低,較具代表性的陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn),加標(biāo)量為200 μg/kg,以陰性樣品進(jìn)行前處理后得到的空白基質(zhì)液,配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)使用5 mL水、20 mL有機(jī)溶劑對(duì)樣品進(jìn)行提取,5 g氯化鈉析出有機(jī)溶劑,75 mg C18凈化,實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次(n=6)的平均回收率作為參考指標(biāo),考察3種不同提取溶劑(乙腈、丙酮和乙酸乙酯)對(duì)5種目標(biāo)物的平均回收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,對(duì)于5種黃芩素,使用丙酮作為溶劑均可獲得相對(duì)較高的平均回收率。這是因?yàn)楸獦O性介于乙酸乙酯及乙腈之間,極性與5種黃芩素相對(duì)接近,更適合提取5種黃芩素。綜上所述,以丙酮作為本實(shí)驗(yàn)提取有機(jī)溶劑,能獲得最佳提取效果。

2.2.2提取溶劑用量的優(yōu)化

由于保健品片劑功效成分多,基質(zhì)復(fù)雜,目標(biāo)物的萃取效率會(huì)受到基質(zhì)中其他組分的影響。此外,提取溶劑用量少,則基質(zhì)干擾增強(qiáng);提取溶劑過多,又將影響實(shí)驗(yàn)的靈敏度,因此需要對(duì)提取溶劑的用量進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)對(duì)保健品片劑進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),探究5個(gè)不同丙酮用量(5、10、15、20、25 mL)對(duì)5種分析物平均回收率的影響,因此其他因素固定為5 mL水、5 g氯化鈉鹽析、75 mg C18吸附劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次(n=6)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示,當(dāng)丙酮的量為5 mL時(shí),野黃芩素、4′-羥基漢黃芩素、去甲漢黃芩素和漢黃芩素的平均回收率均高于110%,且偏差較大,不利于定量分析。當(dāng)丙酮用量為10 mL或以上時(shí),5種分析物的平均回收率比較穩(wěn)定;當(dāng)提取溶劑量進(jìn)一步增加,平均回收率呈現(xiàn)下降趨勢(shì),其中,野黃芩素、去甲漢黃芩素、黃芩素對(duì)條件較敏感,回收率下降幅度較大。這說明在提取過程中,液料比并非越高越好,其原因可能是隨著溶劑量的增加其雜質(zhì)成分溶解性增加,從而導(dǎo)致提取率下降[25,26]。綜合考慮,選擇使用10 mL丙酮提取。

2.2.3吸附劑種類的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了PSA、GCB和C18對(duì)5種目標(biāo)物的凈化效果,實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次(n=6),采用5 mL水分散基質(zhì),10 mL丙酮提取,并加入較少量吸附劑(10、25、50 mg)對(duì)類型進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,GCB對(duì)平面結(jié)構(gòu)的5種黃芩素具有很強(qiáng)的吸附力,5種黃芩素在不同用量的情況下回收率為0～2.86%。PSA對(duì)黃芩素、去甲漢黃芩素、野黃芩素具有較強(qiáng)吸附,在不同用量的情況下均對(duì)3個(gè)目標(biāo)物的完全吸附。這可能是PSA主要作用于黃芩素中的酚羥基,而4′-羥基漢黃芩素及漢黃芩素的C-8位存在甲氧基,甲氧基的供電子共軛效應(yīng)導(dǎo)致同一苯環(huán)上的酚羥基與PSA作用力減弱。但4′-羥基漢黃芩素由于在C-4′位置存在一個(gè)獨(dú)立的酚羥基,因此,PSA對(duì)4′-羥基漢黃芩素吸附力較漢黃芩素強(qiáng)。而C18則對(duì)目標(biāo)物基本無吸附作用,C18可以通過非極性作用吸附樣品中的淀粉、糖類和脂類雜質(zhì),不同用量的吸附劑對(duì)5種目標(biāo)物的回收率見表2。當(dāng)使用C18作為吸附劑時(shí),對(duì)5種分析物均能獲得相對(duì)較高的回收率。

表 2 3種固相萃取劑用量對(duì)5種目標(biāo)物回收率的影響(n=6)

表 3 不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)K值

2.2.4吸附劑用量的優(yōu)化

為了探究5個(gè)不同C18吸附劑用量(25、50、75、100和125 mg)對(duì)5種目標(biāo)物平均回收率的影響,本實(shí)驗(yàn)以10 mL丙酮為提取溶劑,實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次(n=6)。結(jié)果見表2-C18部分。當(dāng)使用75 mg C18作為吸附劑時(shí),5種分析物均能獲得最高回收率;而吸附劑用量多于75 mg時(shí),C18對(duì)野黃芩素和黃芩素表現(xiàn)出較強(qiáng)吸附作用,因此回收率迅速降低。綜上,本實(shí)驗(yàn)選用吸附劑用量為75 mg,經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)C18用量大于75 mg時(shí),野黃芩素、去甲漢黃芩素及黃芩素回收率下降幅度較大,對(duì)C18吸附劑的用量較敏感。原因可能是:過量的C18吸附劑存在可令這3種黃芩素與C18之間產(chǎn)生瞬間偶極作用,產(chǎn)生吸附。瞬間偶極作用的本質(zhì)為分子電荷重心的瞬間偏移,C-8位的甲氧基可降低此相互作用,因此4′-羥基漢黃芩素及漢黃芩素在優(yōu)化范圍條件內(nèi),較不敏感。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的探究

目前市售片劑的主要填料為淀粉、蔗糖、乳糖、預(yù)膠化淀粉、纖維素、無機(jī)鹽等[27],少部分片劑則富含蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)以上填料,選取基本包含以上填料的相對(duì)較具代表性的海參牡蠣保健片、壓片糖果、維生素片等3種保健品片劑基質(zhì),探究基質(zhì)效應(yīng)的影響。采用1.2.1節(jié)的前處理方法,得到空白基質(zhì)液,配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線所得斜率相比,得到比值K。K<0.8表示存在基質(zhì)抑制現(xiàn)象,K>1.2,表示存在基質(zhì)增強(qiáng)現(xiàn)象。結(jié)果(見表3)顯示,不同類型的保健品片劑,由于成分較為復(fù)雜,其5種黃芩素的基質(zhì)效應(yīng)略有差別。在3種保健品片劑基質(zhì)中,野黃芩素及黃芩素在質(zhì)譜分析時(shí),受基質(zhì)干擾程度較低。K值在0.83～1.19之間。而4′-羥基漢黃芩素、去甲漢黃芩素、漢黃芩素均表現(xiàn)出較強(qiáng)的基質(zhì)抑制現(xiàn)象及基質(zhì)增強(qiáng)現(xiàn)象。綜合考慮，最終使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4 線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和檢出限

實(shí)驗(yàn)選取了5種黃芩素呈陰性的壓片糖果,經(jīng)前處理后按照1.2.2節(jié)要求配制基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在優(yōu)化后的色譜及質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定,以各分析物的質(zhì)量濃度為X,以其相應(yīng)的質(zhì)譜峰面積為Y,得到各自的線性方程。結(jié)果顯示,5種黃芩素在線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.995 4～0.998 0。

取基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以1.2.3節(jié)及1.2.4節(jié)條件進(jìn)行測(cè)定,以3倍信噪比(S/N=3)測(cè)定本方法的儀器檢出限,結(jié)合前處理?xiàng)l件得出方法檢出限(LOD)。以10倍信噪比(S/N=10)測(cè)定方法定量限(LOQ)。5種分析物的方法檢出限為0.5～40.0 μg/kg,定量限為2.0～120.0 μg/kg,結(jié)果見表4。由此可見,方法靈敏度較高,可很好地應(yīng)用于保健品片劑中5種黃芩素的檢測(cè)。

表 4 壓片糖果空白基質(zhì)中5種目標(biāo)物的線性關(guān)系、檢出限和定量限

Y: peak area of quantitative ion;X: mass concentration, μg/L.

2.5 方法的回收率和精密度

選擇不含待測(cè)目標(biāo)物的保健品片劑(海參牡蠣保健片、壓片糖果、維生素片)進(jìn)行3水平加標(biāo)回收試驗(yàn),添加水平為定量限的1倍、5倍和10倍,每個(gè)添加水平日內(nèi)重復(fù)6次,計(jì)算得到回收率及精密度。結(jié)果如表5所示,回收率在83.1%～106.5%,精密度在0.97%～4.52%。由回收率和精密度可見,該方法可滿足日常實(shí)驗(yàn)要求。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)使用上述所建立的方法,在最優(yōu)條件下,對(duì)購得的3類保健品片劑(海參牡蠣片、壓片糖果、維生素片各5個(gè))進(jìn)行分析檢測(cè)。15個(gè)樣品中有2個(gè)樣品檢出黃芩素,分別為38.9 μg/kg及39.7 μg/kg, 8個(gè)樣品檢出漢黃芩素,結(jié)果為48.9～2 493.6 μg/kg。野黃芩素、4′-羥基漢黃芩素、去甲漢黃芩素均未檢出。陽性樣品圖見圖5。

表 5 5種目標(biāo)物在樣品中的加標(biāo)回收率及精密度(n=6)

圖 5 不同陽性樣品的提取離子流圖Fig. 5 Extracted ion chromatograms of different positive samples

3 結(jié)論

本文建立了分散固相萃取-HPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定保健品片劑基質(zhì)中的野黃芩素、4′-羥基漢黃芩素、去甲漢黃芩素、黃芩素和漢黃芩素等5種黃酮類目標(biāo)物的分析方法。在優(yōu)化的色譜條件下,5種黃酮類目標(biāo)物在18 min內(nèi)完全出峰且峰形良好。優(yōu)化的分散固相萃取前處理方法對(duì)目標(biāo)物有較好的提取效果。通過對(duì)牡蠣片、壓片糖果和維生素片的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察,使用不同的基質(zhì)曲線對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行校正,并采取方法學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)方法的可行性進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明,該方法回收率高,靈敏度高,重現(xiàn)性好,適用于保健品片劑中這5種黃酮類化合物的含量測(cè)定。