孫靈慧,陳 捷,徐 娟,李敏青,陳文銳

(廣州海關技術中心, 廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室, 廣東 廣州 510623)

當前,糧食作物種植存在過量施用氮肥的現(xiàn)象[1,2],這降低了氮肥利用率,氮素損失嚴重[3],引起一系列的環(huán)境污染問題。三氯甲基吡啶(nitrapyrin),即2-氯-6-三氯甲基吡啶的簡稱,是一種土壤氮肥保護劑,和氮肥配合使用于田間,可以有效地抑制硝化細菌對氨態(tài)氮的硝化作用[4],能減少氮肥損失,延長肥效期,提高化肥的利用率[5]。其原理是延長氮素在土壤中以銨態(tài)氮形態(tài)存在的時間,由此可以減少氮肥以硝態(tài)氮的形式淋溶損失以及反硝化作用[6],此外,三氯甲基吡啶也是重要的農藥醫(yī)藥中間體。近年來國內外對三氯甲基吡啶的研究主要是關于其對土壤的硝化抑制作用及對谷物的增產效果和制備工藝的研究[7-9],對測定其在蔬菜、水果、糧谷等食品中殘留方法的研究資料還相對較少,常見報道都為氨氯吡啶酸的測定[10,11],且采用氣相色譜-三重四極桿質譜技術在玉米及其他糧谷農殘方面的應用在國內外尚未見報道[12],主要參考氣相色譜-三重四極桿質譜法測定蔬菜、水果、糧谷等中其他農藥殘留方法的標準和文獻[13]?，F(xiàn)僅美國、日本和韓國規(guī)定了最大殘留限量,分別規(guī)定了糧食作物及其副產品中三氯甲基吡啶的最大殘留限量范圍為0.1～6 mg/kg;歐盟、加拿大均無相關限量要求。我國香港地區(qū)《食物內除害劑殘余規(guī)例》[14]規(guī)定了三氯甲基吡啶的殘留量,其中,爆谷、高粱及玉米中三氯甲基吡啶及其代謝物6-氯吡啶甲酸之和的建議限量為0.1 mg/kg,小麥的建議限量為0.5 mg/kg。目前,我國GB 2763-2019尚未制定其最大殘留限量。因此,建立三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸的有效檢測方法,可為糧食作物中的代謝研究提供可行的技術支撐,為制定國內糧食作物中三氯甲基吡啶的最大殘留限量提供基礎數(shù)據,對有效控制氮肥施用量、促進農業(yè)的健康發(fā)展、保障廣大人民群眾的食用安全具有深遠的意義。

仇珍等[15]測定了稻米中三氯甲基吡啶代謝物6-氯吡啶甲酸的殘留量,樣品經乙醚提取凈化,導入重氮甲烷甲酯化后定容,使用帶電子捕獲檢測器的氣相色譜儀進行分析。該方法僅檢測了代謝物的殘留量,并且導入的重氮甲烷受熱、遇火、摩擦、撞擊會導致爆炸,危險性高,不適合常規(guī)檢測。本工作在前人研究的基礎上,參考QuEChERS方法[16],選擇了相對安全的衍生試劑濃硫酸,對樣品前處理過程進行了優(yōu)化,結合氣相色譜-三重四極桿質譜法(GC-MS/MS),建立起高粱、小麥、玉米及爆谷等糧食作物中三氯甲基吡啶殘留量的分析方法。該方法操作簡便,前處理成本低,靈敏度高,抗干擾能力強,定性定量準確,彌補了國內糧食作物中三氯甲基吡啶及其代謝產物檢測方法的空白。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ FortisTM型氣相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用儀,配有電子轟擊源(EI+)(賽默飛世爾科技(中國)有限公司); 3-18KS離心機(美國Sigma公司); Biotage全自動氮吹濃縮儀(LV型,美國Biotage公司);賽多利斯BSA124S-CW電子分析天平(賽多利斯科學科學儀器(北京)有限公司);恒溫振蕩水浴箱(北京五洲東方科技發(fā)展公司); MS3 basic渦旋混合器(德國IKA公司); Heidolph Multi Reax多位試管渦旋振蕩器、Heidolph往復式振蕩器、Promax搖床(德國Heidolph公司)。

三氯甲基吡啶(純度99.4%)、6-氯吡啶甲酸(純度99.0%)及2-吡啶甲酸甲酯(純度98.0%)標準品(德國Dr. Ehrenstorfer公司);無水硫酸鎂、氯化鈉(分析純,廣州化學試劑廠);海砂(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);乙酸乙酯、乙腈、甲醇(HPLC級,美國Fisher公司);去離子水由Millipore公司超純水機制得;15 mL QuEChERS凈化管,含200 mg MgSO4、50 mgN-丙基乙二胺(PSA)、100 mg石墨化炭黑(100～200目)、100 mg C18,均購自博納艾杰爾科技公司。

1.2 樣品前處理

取市售具有代表性的糧食作物高粱、小麥、玉米及爆谷各2 kg,用粉碎機粉碎后密封,于陰涼處避光保存。

稱取5 g樣品(精確至0.01 g)至50 mL離心管中,加入15 g海砂攪拌均勻,加入5 mL水渦旋振蕩均勻,靜置10 min。加入10 mL乙腈、0.1 mL甲酸,振搖15 min,加3 g氯化鈉,振搖5 min,于4 000 r/min離心5 min。取4 mL上清液至已配好的15 mL凈化管中渦旋振蕩3 min,取2 mL凈化液待用。將凈化液吹至近干,立即加入1 mL甲醇復溶,在冰水浴中加入200 μL濃硫酸,振勻。于55 ℃水浴搖床中衍生30 min后,于50 ℃氮吹濃縮,用1 mL乙酸乙酯復溶。將復溶液轉移至50 mL離心管,加入5 mL飽和氯化鈉溶液,振蕩提取后移取上清液,再向15 mL離心管中分兩次加入共6 mL乙酸乙酯,振蕩并提取上清液。合并上清液于50 mL離心管中,再加入2 mL 2%(質量分數(shù))的硫酸鈉水溶液,洗滌,移取乙酸乙酯層于吹氮管中,氮吹濃縮至近干,用2 mL正己烷復溶,加入內標物質2-吡啶甲酸甲酯,振勻后經0.2 μm濾膜過濾后,供GC-MS/MS測定。

1.3 色譜條件

色譜柱:THERMOTR-35MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);色譜柱溫度:70 ℃保持1.5 min,以20 ℃/min升溫至180 ℃,然后以5 ℃/min升溫至210 ℃,再以25 ℃/min升溫至280 ℃,保持5 min;載氣:氦氣,純度≥99.999%,流速1.2 mL/min;進樣口溫度:250 ℃;進樣量:1 μL;進樣方式:不分流進樣。

1.4 質譜條件

電子轟擊源:70 eV;離子源溫度:230 ℃;傳輸線溫度:280 ℃;溶劑延遲:3 min;掃描方式:多選擇反應監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring, MRM);待測物的其他參數(shù)見表1,用Mass Hunter工作站進行儀器控制和數(shù)據處理。

表 1 三氯甲基吡啶及其代謝產物的MRM參數(shù)

* 6-Chloro-2-picolinic acid methyl ester is a derivative of the metabolite of nitrapyrin.

圖 1 凈化條件對三氯甲基吡啶及其代謝物回收率的影響Fig. 1 Effects of purification conditions on the recoveries of nitrapyrin and its metabolite

圖 2 衍生時間對衍生物回收率的影響Fig. 2 Effect of the derivatization time on the recovery of the derivative

2 結果與分析

2.1 凈化條件的優(yōu)化

由于糧食作物中含有大量的油脂、糖分等干擾物,容易形成基質干擾,因此必須對其進行凈化處理,以達到減少基質效應的效果。以高粱、小麥、玉米及爆谷為樣品基質,采用QuEChERS方法,添加PSA、石墨炭黑、C18的凈化粉進行凈化。凈化過程中,加標0.2 mg/kg,分別對3種凈化粉的用量進行優(yōu)化(見圖1)。最終選用凈化粉的用量為:MgSO4200 mg、C18 100 mg、PSA 50 mg和GCB 100 mg。

2.2 衍生條件的優(yōu)化

分別考察了衍生時間和衍生物加入量對三氯甲基吡啶及其代謝產物定量測定時的回收率的影響。以玉米基質為例,衍生時間分別選取了10、20、30、60 min。對6-氯吡啶甲酸進行考察,衍生30 min時,回收率達到最高值,隨后略有下降(見圖2)。測定結果顯示,衍生10 min響應最低,20 min后略有升高,之后趨于穩(wěn)定。故選擇衍生時間30 min。

圖 3 硫酸用量對衍生物響應值的影響Fig. 3 Effect of the sulfuric acid amount on the response of the derivative

考察衍生物濃硫酸的添加量,對比同等濃度的6-氯吡啶甲酸標準溶液中添加50、100、200、300 μL濃硫酸后的影響(見圖3)。結果發(fā)現(xiàn),加100 μL濃硫酸即可以衍生完全,轉化率穩(wěn)定。轉化率為衍生后標準物質響應濃度與標準物質理論濃度的比值。在此試驗基礎上發(fā)現(xiàn),在樣品基質中添加相同濃度的標準品時,若僅加100 μL濃硫酸,會因雜質消耗硫酸,導致衍生轉化率下降,而加入200 μL的濃硫酸后結果相對穩(wěn)定。因此,最終對樣品進行衍生時,選擇了添加200 μL濃硫酸。

2.3 色譜柱的選擇

分別考察了色譜柱DB-1701、DB-INOVWAX、DB-5MS和TR-35MS對三氯甲基吡啶及其代謝產物進行色譜分離時的峰形和靈敏度。如圖4所示,DB1701柱和DB-INOVWAX柱僅能分離三氯甲基吡啶,但無法有效分離代謝物;比較另外兩種色譜柱,TR-35MS柱涂漬層為(35%苯基)-聚硅氧烷固定液,可使三氯甲基吡啶和6-氯-2-吡啶羧酸甲酯的峰形尖銳、無拖尾,靈敏度更高,同時色譜柱價格適中,因此選為實驗所用。

圖 4 采用不同色譜柱分離三氯甲基吡啶、6-氯-2-吡啶羧酸甲酯和2-吡啶甲酸甲酯的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of nitrapyrin, 6-chloro-2-picolinic acid methyl ester, and pyridine-2-carboxylic acid methyl ester separated on different columns

2.4 質譜條件的優(yōu)化

利用EI源,在正離子模式下,分別對三氯甲基吡啶和6-氯-2-吡啶羧酸甲酯進行一級質譜分析(Q1掃描),得到母離子峰,對母離子峰進行二級質譜分析(子離子掃描),得到碎片離子信息,由此確定定量、定性離子對。

本方法采用Timed選擇離子模式,由于對離子掃描只在其相應保留時間的一個狹窄區(qū)域內進行,因此,相對于常規(guī)的選擇離子模式,在整個相同的掃描過程中,可以使更多對離子獲得更長的駐留時間,從而提高靈敏度,且盡可能減少峰與峰之間的相互干擾。

采用MRM模式采集數(shù)據,通過優(yōu)化碰撞能量,使各離子對達到最好響應,MRM參數(shù)見表2。

三氯甲基吡啶、6-氯-2-吡啶羧酸甲酯和2-吡啶甲酸甲酯(內標)的標準品全掃描質譜圖及多反應監(jiān)測色譜圖見圖5和圖6。

圖 5 三氯甲基吡啶、6-氯-2-吡啶羧酸甲酯和2-吡啶甲酸甲酯標準品的全掃描質譜圖Fig. 5 Full scan mass spectra of nitrapyrin, 6-chloro-2-picolinic acid methyl ester, and pyridine-2-carboxylic acid methyl ester standards

圖 6 三氯甲基吡啶、6-氯-2-吡啶羧酸甲酯和2-吡啶甲酸甲酯標準品的MRM色譜圖Fig. 6 MRM chromatograms of nitrapyrin, 6-chloro-2-picolinic acid methyl ester, and pyridine-2-carboxylic acid methyl ester standards

2.5 基質效應

按如下計算方法對基質效應(ME)進行評價:ME=(空白基質匹配標準曲線斜率/純溶劑標準曲線斜率-1)×100%。當ME為負值時表示存在基質抑制效應,正值時表示存在基質增強效應;絕對值越大則基質效應越強,如恰好為0,則表示不存在基質效應[17]。結果表明,三氯甲基吡啶在各基質溶液中受到一定的基質增強作用,爆谷和玉米樣品的基質效應最為明顯,為+13.6%;而其代謝物的衍生物6-氯-2-吡啶羧酸甲酯在各基質溶液中受到一定的基質抑制作用,尤其是爆谷樣品基質抑制效應最為明顯,為-57.1%,玉米樣品的基質效應略低,為-48.2%?？偟膩碚f,小麥和高粱的基質效應相對較小。對于糧谷類基質而言,經本方法凈化處理后,目標化合物的基質效應均在可接受范圍內。采用基質匹配內標法測定實際樣品,也可在一定程度上對基質效應的影響進行補償。

2.6 線性范圍、線性方程和檢出限

用空白基質溶液(不含三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸的高粱、小麥、玉米及爆谷樣品)分別配制質量濃度為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L的系列三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸的基質匹配溶液,對其進行分析,分別以三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸標準工作溶液質量濃度為橫坐標(X),以三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸定量離子峰面積除以內標峰面積的值與內標質量濃度的乘積為縱坐標(Y),繪制標準工作曲線,所得線性方程及相關系數(shù)(r2)見表3。當樣品中三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸的質量濃度超出0.025～0.4 mg/L這一線性范圍時,適當加大樣品的稀釋倍數(shù)。

在本方法測定條件下,以信噪比(S/N)>3時基質標準溶液的濃度乘以方法的稀釋倍數(shù)推算出方法檢出限(LOD)。選擇空白玉米樣品,當添加水平為0.05 mg/kg時,S/N>10,表明其定量限(LOQ)可達到0.05 mg/kg。該定量限滿足我國香港地區(qū)《食物內除害劑殘余規(guī)例》[14]中的最高殘留限量要求。檢出限及定量限結果見表2。

2.7 回收率和精密度

在不同空白樣品基質中添加3個水平(0.05、0.1、0.2 mg/kg)的標準品進行加標回收試驗,每個添加水平重復6次,結果見表3。結果表明,三氯甲基吡啶及6-氯吡啶甲酸的回收率為80.4%～98.4%,相對標準偏差為1.0%～10.1%(n=6),方法的精密度和準確度能夠滿足定量分析的要求。

2.8 實際樣品的檢測

隨機購買市售的高粱樣品15個、小麥樣品10個、玉米12個及爆谷15個,按照本研究建立的檢測方法進行測定,52種糧食作物均未檢出三氯甲基吡啶及其代謝產物。

表 2 不同基質中三氯甲基吡啶及其代謝物的線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限

Y: peak area of product ion/peak area of internal standard×mass concentration of internal standard;X: mass concentration, g/L. Linear range: 0.025-0.4 mg/L.

表 3 不同基質中三氯甲基吡啶及其代謝物的加標回收率和精密度(n=6)

3 結論

本研究采用酸性乙腈提取,QuEChERS方法凈化,濃硫酸衍生后提取衍生物,建立了同時測定糧食作物中三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸殘留的氣相色譜-三重四極桿質譜檢測方法,回收率、精密度和檢出限均滿足糧食作物中三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸殘留限量的要求。