曹惠敏 楊云霜 余雷 杜磊 李延暉 張蓉

〔摘要〕 目的 探討自擬中藥補(bǔ)腎解毒方對(duì)小鼠胸腺、脾臟、白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的影響。方法 將90只清潔級(jí)小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、輻射模型組、氨磷汀陽(yáng)性對(duì)照組、補(bǔ)腎解毒方預(yù)防組、補(bǔ)腎解毒方防治結(jié)合組。造模前各組分別進(jìn)行相應(yīng)處理。除空白對(duì)照組外，其余4組小鼠均接受劑量為6 Gy的60Co γ射線的輻射;并于輻射后第1天、第7天、第14天分批處死小鼠，記錄小鼠體質(zhì)量及胸腺、脾臟質(zhì)量，計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù);眼球采血并采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞總數(shù)。結(jié)果 （1）輻射后第1天，與空白對(duì)照組相比，各組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均明顯下降（P<0.01）;輻射后第7天，補(bǔ)腎解毒方預(yù)防組和補(bǔ)腎解毒方防治結(jié)合組胸腺指數(shù)明顯高于輻射模型組（P<0.05或P<0.01）;輻射后第14天，補(bǔ)腎解毒方預(yù)防組、補(bǔ)腎解毒方防治結(jié)合組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)高于氨磷汀陽(yáng)性對(duì)照組和輻射模型組（P<0.01或P<0.05）。（2）輻射后第1天，與空白對(duì)照組相比，各組小鼠白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞均明顯下降（P<0.01）;輻射后第7天，補(bǔ)腎解毒方預(yù)防組和補(bǔ)腎解毒方防治結(jié)合組淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯高于氨磷汀陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.05）;輻射后第14天，補(bǔ)腎解毒方預(yù)防組、補(bǔ)腎解毒方防治結(jié)合組小鼠白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞明顯高于輻射模型組和氨磷汀陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.01或P<0.05）。結(jié)論 補(bǔ)腎解毒方能夠促進(jìn)輻射后胸腺和脾臟的恢復(fù)，提高外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞總數(shù)，具有良好的輻射防護(hù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕 補(bǔ)腎解毒方;輻射;免疫器官;免疫細(xì)胞

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.03.007

〔Abstract〕 Objective To explore the effect of self-made Chinese materia medica Bushen Jiedu Prescription on thymus， spleen， white blood cells， lymphocytes in mice. Methods A total of 90 clean-grade mice were randomly divided into a blank control group， a radiation model group， a amifostine-positive control group， a Bushen Jiedu Prescription prevention group， and a Bushen Jiedu Prescription prevention and treatment group. Each group was processed separately before modeling. Except for the blank control group， the other four groups received a dose of 6 Gy of 60Co γ ray radiation. The mice were killed in batches on the 1st， 7th， and 14th day after radiation. The body weight， thymus and spleen mass were recorded and the spleen coefficient and thymus coefficient were calculated. Blood was taken from the eyeball and blood routine test was performed using an automatic biochemical analyzer to count the total number of white blood cells and lymphocytes. Results （1） On the 1st day after radiation， compared with the blank control group， the thymus index and spleen index of the mice in each group decreased significantly （P<0.01）. On the 7th day after radiation， the thymus index of the Bushen Jiedu Prescription prevention group and the Bushen Jiedu Prescription prevention and treatment group were significantly higher than the radiation model group （P<0.05 or P<0.01）. On the 14th day after radiation， the thymus and spleen mass of Bushen Jiedu Prescription prevention group and Bushen Jiedu Prescription prevention and treatment group were higher than the amifostine positive control group and the radiation model group （P<0.01 or P<0.05）. （2） On the 1st day after radiation， compared with the blank control group， the white blood cells and lymphocytes of each group were significantly decreased （P<0.01）. On the 7th day after radiation， the number of lymphocytes in the Bushen Jiedu Prescription prevention and treatment group and Bushen Jiedu Prescription prevention group was significantly larger than that of the amifostine positive control group （P<0.05）. On the 14th day after radiation， the white blood cells and lymphocytes of the mice in the Bushen Jiedu Prescription prevention and treatment group and Bushen Jiedu Prescription prevention group were significantly higher than those in the amifostine positive control group and the radiation model group （P<0.01 or P<0.05）. Conclusion Bushen Jiedu Prescription can promote the recovery of thymus and spleen after radiation， increase the total number of peripheral blood leukocytes and lymphocytes， and has a good radiation protection effect.

〔Keywords〕 Bushen Jiedu Prescription; radiation; immune organ; immune cell

輻射廣泛應(yīng)用于生活各個(gè)領(lǐng)域，與人類生活密切相關(guān)，但其造成機(jī)體多方面的損傷越來(lái)越常見[1-2]。其中免疫系統(tǒng)急性損傷的治療已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)抗輻射研究中的熱點(diǎn)。中藥具有資源豐富、毒副作用小、發(fā)展前景好等特點(diǎn)，在免疫器官的放射損傷治療中表現(xiàn)出良好的保護(hù)作用，漸漸成為輻射損傷防護(hù)的熱點(diǎn)研究方向[3-4]。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)六味地黃丸可以顯著降低輻射對(duì)胸腺和脾臟等免疫器官的損傷[5]，遂在其方劑基礎(chǔ)上結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)，酌情減量熟地黃，優(yōu)化組合冬蟲夏草、白花蛇舌草等扶正益氣類中藥，自擬形成補(bǔ)腎解毒方。在既往研究中發(fā)現(xiàn)，使用2 Gy、4 Gy 60Co γ射線對(duì)小鼠進(jìn)行輻射，補(bǔ)腎解毒方能夠升高輻射后外周血液中血小板等的數(shù)量，增加IL-12、γ-IFN等細(xì)胞因子的含量，保護(hù)卵巢等重要生殖器官，提高機(jī)體免疫[6-8]。為進(jìn)一步探究在較大劑量輻射下補(bǔ)腎解毒方對(duì)免疫系統(tǒng)損傷的防護(hù)作用，擬選用6 Gy 60Co γ射線對(duì)小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，增設(shè)氨磷汀陽(yáng)性對(duì)照組和補(bǔ)腎解毒方預(yù)防組，并從胸腺、脾臟、外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等方面對(duì)其抗輻射作用進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由南京大學(xué)生物醫(yī)藥研究院提供C57BL/10J的清潔級(jí)健康成年小鼠90只，體質(zhì)量為（20±2） g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0008。自由進(jìn)水?dāng)z食，普通顆粒飼料飼養(yǎng)。

1.2 ?藥品

補(bǔ)腎解毒方方劑組成：澤瀉、山藥、牡丹皮、茯苓、熟地黃、白花蛇舌草各10 g，山茱萸12 g，冬蟲夏草3 g，由北京康仁堂藥業(yè)有限公司配制，配方顆粒由無(wú)菌水加熱煮沸。0.9%氯化鈉注射液購(gòu)于山東科倫藥業(yè)有限公司，規(guī)格50 mL/袋。氨磷汀注射液購(gòu)于大連美羅藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格0.4 g/只。

1.3 ?儀器

電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）、邁瑞B(yǎng)C-5180全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）、低溫離心機(jī)5810R型（德國(guó)Eppendorf公司）、美菱醫(yī)用冷凍冷藏冰箱（中國(guó)長(zhǎng)虹美菱有限公司）、超凈臺(tái)（中國(guó)Airtech公司）等均由火箭軍特色醫(yī)療中心檢驗(yàn)科提供。

1.4 ?造模

將90只C57BL/10J清潔級(jí)小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、氨磷汀陽(yáng)性對(duì)照組（簡(jiǎn)稱：氨磷汀組）、輻射模型組、補(bǔ)腎解毒方預(yù)防組（簡(jiǎn)稱：中藥預(yù)防組）、補(bǔ)腎解毒方防治結(jié)合組（簡(jiǎn)稱：中藥防治組），每組18只。小鼠補(bǔ)腎解毒方給藥劑量參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，按照折算指數(shù)法將人體給藥劑量換算為小鼠等效劑量作為小鼠給藥劑量為13.5 g/（kg·d）。

1.5 ?干預(yù)

適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后，于每天上午8：00對(duì)各組小鼠進(jìn)行灌胃處理，中藥預(yù)防組和中藥防治組給予13.5 g/（kg·d）補(bǔ)腎解毒方劑，空白對(duì)照組、輻射模型組、氨磷汀組給予13.5 g/（kg·d）的0.9%氯化鈉溶液，5組均連續(xù)灌胃10 d;第11天早上于輻射前1小時(shí)對(duì)氨磷汀對(duì)照組小鼠腹腔注射氨磷汀注射液，并對(duì)空白對(duì)照組外的其他4組小鼠進(jìn)行6 Gy的60Co γ射線輻射，鼠籠距離輻射源20 cm，吸收劑量率約為1 Gy/min，總時(shí)長(zhǎng)約6 min。輻射后繼續(xù)于每天上午8：00對(duì)各組小鼠進(jìn)行灌胃處理，持續(xù)時(shí)間14 d，除中藥防治組給予中藥干預(yù)外，其他4組均予以生理鹽水干預(yù)。

1.6 ?實(shí)驗(yàn)取材及指標(biāo)檢測(cè)

于輻射后第1天、第7天、第14天對(duì)各組小鼠進(jìn)行取材，每次6只。電子天平稱取小鼠體質(zhì)量、脾臟及胸腺質(zhì)量，計(jì)算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)（胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量）。小鼠眼球采血，采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定外周血中白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞總數(shù)。

脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量

1.7 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行One-way ANOVA和T Test分析，用“x±s”表示各組數(shù)據(jù)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?各組小鼠生理情況

輻射前，各組小鼠健康狀況和精神狀態(tài)良好，飲食飲水正常;輻射后當(dāng)日，空白對(duì)照組小鼠一切正常，其他4組出現(xiàn)食欲不振、驚恐不安、精神萎靡等現(xiàn)象;輻射模型組、氨磷汀組小鼠體質(zhì)量明顯下降，毛色黯淡，精神不振，部分小鼠出現(xiàn)片狀脫毛，中藥預(yù)防組和中藥防治組體質(zhì)量未出現(xiàn)明顯下降，健康狀況及精神狀態(tài)均一般。輻射模型組自然死亡共2只，其余組無(wú)死亡。自然死亡小鼠體型消瘦，解剖可見小鼠胃腸道出現(xiàn)多處損傷及壞死，肝臟、脾臟充血，其余臟器未見明顯異常變化。

2.2 ?胸腺指數(shù)

輻射后第1天，與空白對(duì)照組相比，輻射模型組胸腺指數(shù)明顯下降（P<0.01）;與輻射模型組相比，中藥預(yù)防組輻射后胸腺指數(shù)明顯較高（P<0.01），同時(shí)中藥預(yù)防組胸腺指數(shù)高于氨磷汀組（P<0.05），其余各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。輻射后第7天，輻射模型組仍低于空白對(duì)照組（P<0.01）;同時(shí)中藥預(yù)防組和中藥防治組與輻射模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）;且中藥預(yù)防組胸腺指數(shù)接近空白對(duì)照組水平，其余各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。輻射后第14天，輻射模型組胸腺指數(shù)仍顯著低于空白對(duì)照組（P<0.01）;同時(shí)中藥預(yù)防組和中藥防治組胸腺指數(shù)升高，接近空白對(duì)照組水平（P>0.05），且明顯高于氨磷汀組（P<0.05）。中藥預(yù)防組第14天胸腺指數(shù)高于同組第1天（P<0.05）;中藥防治組第14天胸腺指數(shù)高于同組第1天（P<0.01）。結(jié)果見表1。

2.3 ?脾臟指數(shù)

輻射后第1天，與空白對(duì)照組相比，輻射模型組脾臟指數(shù)明顯下降（P<0.01）;與輻射模型組相比，中藥預(yù)防組和中藥防治組脾臟指數(shù)明顯較高（P<0.05）;同時(shí)中藥預(yù)防組和中藥防治組高于氨磷汀組（P<0.05）。輻射后第7天，各組脾臟指數(shù)仍低于空白對(duì)照組（P<0.01）;其余各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。輻射后第14天，輻射模型組脾臟指數(shù)仍低于空白對(duì)照組（P<0.01）;中藥預(yù)防組、中藥防治組脾臟指數(shù)逐漸恢復(fù)正常，與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），同時(shí)明顯高于輻射模型組（P<0.01），且中藥預(yù)防組、中藥防治組脾臟指數(shù)均明顯高于氨磷汀組（P<0.05）;中藥預(yù)防組、中藥防治組第14天脾臟指數(shù)與同組第1天，第7天相比差異明顯（P<0.01）。結(jié)果見表2。

2.4 ?白細(xì)胞

輻射后第1天，與空白對(duì)照組比較，輻射模型組外周血白細(xì)胞數(shù)量明顯下降（P<0.01）;與輻射模型組相比，中藥預(yù)防組和氨磷汀組白細(xì)胞數(shù)量明顯較高（P<0.05）;其余各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。輻射后第7天，各組白細(xì)胞雖有緩慢上升趨勢(shì)，但與空白對(duì)照組間差異依然明顯存在（P<0.01）。輻射后第14天，與空白對(duì)照組相比，輻射模型組仍處于較低水平（P<0.01）;與輻射模型組相比，中藥防治組白細(xì)胞數(shù)量明顯升高（P<0.01）;同時(shí)中藥預(yù)防組和防治組白細(xì)胞數(shù)量多于氨磷汀組（P<0.01或P<0.05）。中藥預(yù)防組和中藥防治組第14天白細(xì)胞數(shù)量高于同組第1天，第7天（P<0.01或P<0.05）。結(jié)果見表3。2.5 ?淋巴細(xì)胞

輻射后第1天，與空白對(duì)照組相比，輻射模型組外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯下降（P<0.01），與輻射組相比，中藥防治組淋巴細(xì)胞數(shù)量在輻射后明顯升高（P<0.05）;其余組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。輻射后第7天，與空白對(duì)照組相比，各組淋巴細(xì)胞有不同程度升高，但差異仍存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;中藥預(yù)防組和中藥防治組淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯高于氨磷汀組（P<0.05），其余組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。輻射后第14天，除中藥預(yù)防組外，其余各組與空白組相比差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與輻射模型組相比，中藥預(yù)防組和中藥防治組淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯升高（P<0.01或P<0.05）;同時(shí)中藥防治組與氨磷汀組差異具有顯著性（P<0.05）。輻射后中藥預(yù)防組和防治組淋巴細(xì)胞總體呈緩慢上升趨勢(shì)，且第14天高于同組第1天、第7天（P<0. 01或P<0.05）。結(jié)果見表4。

3 討論

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為電離輻射暴戾猛烈，直中臟腑，聚于三焦，耗氣傷精，導(dǎo)致氣血陰液虧虛[9]。輻射可引起乏力嘔吐，產(chǎn)生急性放射病，導(dǎo)致器官衰竭，癌變幾率增加甚至死亡[1，10]。目前臨床中暫無(wú)理想的抗輻射藥物。前期實(shí)驗(yàn)[5]已經(jīng)表明六味地黃丸能夠降低輻射損傷，但熟地黃用量較大有礙脾胃，易造成大鼠食欲明顯下降，遂對(duì)該方進(jìn)行改良并結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)，優(yōu)化熟地用量至10 g，同時(shí)添加冬蟲夏草3 g、白花蛇舌草10 g，形成補(bǔ)腎解毒方劑。該方具有清熱滋陰、解膩益氣的功效[6]。六味地黃丸方劑中三補(bǔ)平衡五臟，三瀉利濕排濁，二者協(xié)同增效，具滋陰補(bǔ)腎、滲濕利水之能，添精益髓、甘淡利竅之用[11-12]，其君藥熟地黃富含地黃素、地黃苷等多種主要成分，可調(diào)節(jié)免疫、增強(qiáng)機(jī)體防御、保護(hù)心血管等[13];文獻(xiàn)報(bào)道冬蟲夏草能夠成功干預(yù)免疫抑制模型小鼠體質(zhì)量，升高血液中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，促進(jìn)其免疫功能的恢復(fù)，是保肺補(bǔ)腎益精的良藥[14-15]。瞿俊勇等[16-17]發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草多糖可以顯著升高胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)，對(duì)胸腺和脾臟的恢復(fù)有促進(jìn)作用，同時(shí)白花蛇舌草總黃酮能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞的增殖，增加IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子的含量。

氨磷汀是用于腫瘤放療和化療的廣譜細(xì)胞保護(hù)劑[18]。國(guó)外研究者也在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)氨磷汀在輻射后可以保護(hù)正常人淋巴細(xì)胞，減輕DNA損傷并減少其凋亡[19]，在體內(nèi)主要通過堿性磷酸酶途徑脫磷酸，生成具有細(xì)胞保護(hù)作用的代謝產(chǎn)物，包括游離硫醇、半胱胺、亞磺酸、WR-33278，進(jìn)而在放療和化療中選擇性地保護(hù)正常組織[20-21]。但在臨床使用中氨磷汀存在較多不良反應(yīng)且發(fā)生率較高，極大地限制了其的應(yīng)用。

免疫系統(tǒng)是抗輻射研究中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，胸腺和脾臟作為免疫系統(tǒng)的核心臟器，是機(jī)體抵御外邪侵入的重要防線，也是白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞分化、增殖的主要場(chǎng)所。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠胸腺和脾臟，輻射后第1天，補(bǔ)腎解毒方預(yù)防組和結(jié)合組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯高于輻射組和氨磷汀組;輻射后第7天，機(jī)體自身免疫系統(tǒng)處于調(diào)控狀態(tài)，各組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)有不同程度升高，補(bǔ)腎解毒方預(yù)防組和結(jié)合組小鼠胸腺指數(shù)高于輻射模型組;輻射后第14天，補(bǔ)腎解毒方預(yù)防組和結(jié)合組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)接近正常組水平，與輻射組和氨磷汀組存在明顯差異，提示補(bǔ)腎解毒方可以抵抗較大劑量輻射對(duì)胸腺和脾臟造成的急性損傷，減輕輻射初期機(jī)體免疫系統(tǒng)的損傷程度，亦可以促進(jìn)輻射后期免疫器官的恢復(fù)。

小鼠外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，輻射后第1天，除空白組外的4組小鼠外周血中白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量劇烈下降，各組差異無(wú)明顯區(qū)別。輻射后第7天各組小鼠白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞均有小幅度上升，其中補(bǔ)腎解毒方預(yù)防組升高較為明顯，輻射后第14天，補(bǔ)腎解毒方預(yù)防組和結(jié)合組的白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯高于輻射組和氨磷汀組，提示補(bǔ)腎解毒方在能夠提高輻射小鼠外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的總數(shù)。

實(shí)驗(yàn)中觀察到氨磷汀組在輻射初期有較明顯的細(xì)胞保護(hù)作用，但輻射后期其小鼠白細(xì)胞總數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與輻照組無(wú)明顯區(qū)別;補(bǔ)腎解毒方預(yù)防組和結(jié)合組小鼠輻射后第1天各檢測(cè)指標(biāo)有所下降，但高于輻射組和氨磷汀組;輻射后第7天，由于中藥的干預(yù)作用和免疫系統(tǒng)的自我調(diào)節(jié)作用，補(bǔ)腎解毒預(yù)防組和結(jié)合組各項(xiàng)指標(biāo)均有回升，輻射后第14天補(bǔ)腎解毒方預(yù)防組和結(jié)合組小鼠脾臟指數(shù)接近正常組，防護(hù)效果較為穩(wěn)定。綜上提示補(bǔ)腎解毒方具有較好的的抗輻射作用。

值得考慮的是：此次試驗(yàn)中補(bǔ)腎解毒方結(jié)合組輻射防護(hù)效果并未明顯優(yōu)于預(yù)防組，其原因可能是由于小鼠遭受高劑量電離輻射，胃腸組織損傷嚴(yán)重，消化吸收功能受到影響，從而影響該藥的防護(hù)效應(yīng)。且在取材中發(fā)現(xiàn)小鼠胃腸道多處損傷及壞死，盲腸段膨大等，佐證了這一猜想。如何解決藥物對(duì)輻射損傷胃腸功能的保護(hù)作用，有待進(jìn)一步研究。

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