賈龍剛,王 英,路福平,劉夫鋒
(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室,天津市工業(yè)微生物重點實驗室,天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457)
帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種典型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性病[1].世界帕金森病協(xié)會統(tǒng)計資料顯示,目前全球已有500 多萬PD 患者,是繼腦卒中后遺癥、癲癇之后危害神經(jīng)系統(tǒng)的第3 大類疾病.據(jù)報道[2-3]:每年每10 萬人中就有10~18 個人患PD,其中男性與女性患者比例約為3﹕2.隨著年齡增長,發(fā)病率會逐年增加,80 歲以上發(fā)病率和年齡呈指數(shù)增長.預(yù)計[4]到2030 年,全球50 歲以上中老年人中,PD 患者將達870~930 萬.
雖然對于PD 的發(fā)病機制和致病機理尚未完全解析,但現(xiàn)有研究[5-6]表明多種因素參與其中,包括細胞自發(fā)性過程如自噬和溶酶體功能障礙等.PD 的主要病理特征是在病人黑質(zhì)致密部或其他有顏色的核心結(jié)構(gòu)的多巴胺能神經(jīng)元中含有一種嗜酸性細胞質(zhì)內(nèi)含物,即路易小體,而α-突觸核蛋白(α-synuclein,α SN)是路易小體的主要成分[7-8].α SN 能夠聚集形成一系列大小和形狀各異的聚集體,這些聚集體會毒害細胞、破壞神經(jīng)信號傳遞,從而與PD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7].因此,α SN 的聚集及其抑制劑開發(fā)就成為近年來的研究熱點.
目前,該蛋白的來源主要有以下兩種:生物表達法和組織提取法.Zhao 等[9]將α SN 基因連接至pET15b 載體中,在大腸桿菌中表達獲得含有標簽的融合蛋白,利用TEV 蛋白酶將融合標簽切除后獲得α SN.然而,切除標簽的過程復(fù)雜,后期還需經(jīng)過離子交換、分子篩、Ni 柱親和層析等繁瑣的純化步驟,效率較低.另外,乙酰基修飾的α SN 也在大腸桿菌(Escherichia coli)中成功表達,重組細胞經(jīng)蒸煮和硫酸銨沉淀法得到粗蛋白,再依次經(jīng)過離子交換層析和凝膠過濾層析獲得較純的α SN 蛋白[10].然而,蒸煮過程中可能造成蛋白失活或沉淀,同時多步驟純化會大大降低蛋白的產(chǎn)量.綜上所述,目前α SN 的表達純化方法尚存在步驟繁瑣和產(chǎn)量較低等問題[11].這些均制約著對α SN 聚集特性研究及相關(guān)抑制劑的開發(fā).
本研究提供了一種簡便高效的在大腸桿菌中表達純化α SN 的方法,優(yōu)化了表達及純化條件,并通過硫磺素T(ThT)熒光實驗分析了該重組蛋白的聚集特性,利用細胞毒理學(xué)實驗研究了α SN 聚集體的細胞毒性.
本實驗室保存的大腸桿菌(Escherichia coli)Jm109 和BL21(DE3)用于本研究中α SN 的表達.
表達載體質(zhì)粒pET22b,Novagen 公司;Ni-NTA瓊脂糖樹脂,Qiagen 公司;高保真DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶及限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ,寶生物工程(大連)有限公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒,北京索來寶科技有限公司;硫磺素T(ThT),Sigma 公司;表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG),Tocris 公司;其他試劑均為分析純,上海生工生物工程股份有限公司.
根據(jù)α SN 氨基酸序列,經(jīng)密碼子偏好性優(yōu)化后獲得相應(yīng)DNA 序列.DNA 片段、PCR 引物和測序由蘇州金唯智公司完成.
將合成的α SN 基因用NdeⅠ和XhoⅠ進行雙酶切,回收酶切產(chǎn)物α SN,與具有相同黏性末端的pET22b 載體于16 ℃連接4 h;轉(zhuǎn)化大腸桿菌Jm109感受態(tài)細胞,37 ℃培養(yǎng)12 h;挑取陽性轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR 驗證(NdeⅠ-F:GGAATTCCATATGGATGTG TTTATGAAAGGCCT,XhoⅠ-R:CCGCTCGAGGGC TTCCGGTTCATAATCCT),并提取質(zhì)粒進行測序鑒定.
將上述構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET22b-α SN 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),獲得轉(zhuǎn)化子BL21-α SN,37 ℃靜置過夜培養(yǎng).挑取單菌落至5 mL LB 培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜.按1%接種量轉(zhuǎn)接至200 mL 新鮮LB 培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至A600=0.6~0.8.然后,加入終濃度0.5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo),誘導(dǎo)溫度為16 ℃或 37 ℃,誘導(dǎo) 時 間分 別 為 16 ~18 h 或 4 h.6 000 r/min 離心10 min 收集菌體.BL21 為對照組,誘導(dǎo)條件:IPTG 濃度0.5 mmol/L,誘導(dǎo)溫度16 ℃,誘導(dǎo)時間18 h.
用裂解緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,150 mmol/L NaCl,20 mmol/L 咪唑,1 mmol/L DTT)將上述所得菌體重懸,加入終質(zhì)量濃度為30μg/mL的溶菌酶和體積分數(shù)為 1%的苯甲基磺酰氟(PMSF),冰浴30 min 后超聲破碎(超聲功率250 W,開啟 2.5 s,關(guān)閉 3 s,總時間 15 min).4 ℃、12 000 r/min 離心30 min,收集上清液.將上清液與Ni+樹脂在4 ℃下結(jié)合30 min 后加入到親和層析柱中.待流出液完全流出后,用10 倍柱體積含不同濃度咪唑的清洗液(20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,150 mmol/L NaCl,咪唑濃度分別為 10、20、30、40 mmol/L,1 mmol/L DTT)洗滌樹脂,最后用10 倍柱體積的洗脫液(20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,150 mmol/L NaCl,100 mmol/L 咪唑,1 mmol/L DTT)洗脫,最終獲得目標蛋白溶液.
取20μL 上述各組分樣品,加入5μL 蛋白上樣緩沖液,沸水浴10 min 后離心,取上清液進行檢測.電泳過程:60 V 保持30 min,調(diào)節(jié)電壓至120 V,約1 h 后停止電泳.將凝膠取下,切除濃縮膠部分,將剩余膠塊放入考馬斯亮藍染液中,室溫染色30 min,之后將膠塊置于漂洗液中過夜漂洗.
取誘導(dǎo)后的BL21 和BL21-α SN 細胞破碎上清液及沉淀,沸水浴10 min 后離心,取2μL 上清液滴定至PVDF 膜上.另外選擇帶有His 標簽的脂肪酶蛋白作為陽性對照,同樣取2μL 上清液滴到PVDF 膜上,待晾干后將PVDF 膜放入5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h.之后用pH 8.0 的TBS-T 緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,150 mmol/L NaCl,體積分數(shù)0.05%吐溫20)清洗4 次.將封閉后的PVDF 膜放入鼠抗His 抗體溶液中,4 ℃過夜孵育.將孵育一抗后的PVDF 膜用TBS-T 緩沖液(pH 8.0)清洗4 次,放入羊抗鼠抗體IgG 中,室溫孵育2~3 h.經(jīng)TBS-T 緩沖液清洗4 次后,用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)檢測結(jié)果.抗體稀釋倍數(shù)均為 1﹕10 000,一抗用5%脫脂奶粉溶液稀釋,二抗IgG 用TBS-T 緩沖液稀釋.
將上述SDS-PAGE 蛋白膠中目標蛋白條帶切下,置于1.5 mL EP 管中,送至天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院分析測試中心進行質(zhì)譜分析.
利用ThT 熒光實驗來檢測α SN 聚集特性[12-13],α SN 采用非原位培養(yǎng)法.取適量上述α SN 凍干粉,用20 mmol/L TBS 緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,pH 5.4,150 mmol/L NaCl)溶解,超聲10 min 后,4 ℃、16 000 r/min 離心20 min,取上層溶液體積的75%.利用Nanodrop 2000(美國Thermo Fisher Scientific 公司)檢測蛋白濃度,并配成終濃度為50μmol/L 的α SN 溶液.將上述溶液在含與不含EGCG 條件下置于37 ℃搖床180 r/min 振蕩培養(yǎng).
ThT 溶液同樣利用TBS 緩沖液配制,終濃度為250μmol/L.在不同時間點分別取10μL 上述培養(yǎng)液,加入90μL ThT 溶液,充分混勻.利用Infinite 200 PRO 多功能酶標儀(奧地利TECAN 公司)檢測各樣品熒光強度,激發(fā)波長為440 nm,發(fā)射波長為485 nm.
利用MTT 比色法來檢測α SN 聚集體的細胞毒性.首先用DMEM 培養(yǎng)基(10% FBS,2 mmol/L L-谷氨酰胺,100 IU/mL 青霉素和100μg/mL 的鏈霉素)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)PC12 細胞.然后將細胞接種于96 孔板中(5 000 個/孔),培養(yǎng)24 h 后,加入已培養(yǎng)5 d 的待測樣品,使得蛋白的終濃度為5μmol/L.細胞中加入相同體積PBS 緩沖液為空白對照組.共培養(yǎng) 48 h 后,加入終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 的MTT 溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后取出.離心后丟棄上清液,加入100μL DMSO 溶解細胞,37 ℃孵育10 min 后利用多功能酶標儀檢測上述樣品在570 nm 處的吸光度.
α SN 含140 個氨基酸,相對分子質(zhì)量約為1.5×104[14].α SN 的N 端(1—60 位氨基酸)包含一個高度保守肽段KTKEGV,這種重復(fù)序列是典型的載脂蛋白結(jié)合域[15].C 端(96—140 位氨基酸)序列中富含酸性氨基酸殘基和脯氨酸.中間61—95 位氨基酸序列為非β-淀粉樣蛋白組分區(qū)域(NAC),該肽段在α SN聚集過程中扮演重要角色[16-17].首先基于大腸桿菌密碼子偏好性,對目標基因進行密碼子優(yōu)化,獲得完整的α SN cDNA 序列.將合成的α SN 基因片段與含有相同黏性末端的表達載體框架pET22b 連接,構(gòu)建pET22b-α SN 表達載體(圖1(a)).連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Jm109,轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR 驗證,結(jié)果如圖1(b)所示.圖中結(jié)果顯示4 個轉(zhuǎn)化子的PCR 產(chǎn)物大小與α SN 基因(429 bp)理論值一致.提取質(zhì)粒進一步測序驗證,結(jié)果顯示未發(fā)生突變,證明表達載體構(gòu)建成功.
圖1 表達載體pET22b-α SN 的構(gòu)建Fig.1 Construction of expression plasmid pET22b-α SN
將上述驗證正確的表達載體質(zhì)粒pET22b-α SN轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達宿主BL21(DE3),獲得重組工程菌,命名為BL21-α SN.
上述構(gòu)建好的BL21-α SN 工程菌利用IPTG 進行誘導(dǎo)表達,收集菌體經(jīng)細胞破碎后,SDS-PAGE 分別檢測細胞破碎上清液和沉淀,結(jié)果如圖2(a)所示.目標蛋白主要位于破碎上清液中,沉淀中少量的目標蛋白可能是由于破碎不完全或分離不完全造成的,而空白對照組BL21 野生菌的細胞破碎上清液和沉淀都沒有目的條帶,說明α SN 已成功可溶性表達.圖2(a)中顯示目的條帶大小約為2.0×104,與理論大小(1.5×104)有一定的差距,這主要是由目標蛋白C 端的酸性氨基酸區(qū)域結(jié)合SDS 能力較弱所造成的[18].
圖2 α SN 的表達及鑒定Fig.2 Expression and identification of α SN
為驗證目標產(chǎn)物為α SN,將目標蛋白條帶切下,利用MALDI-TOF 質(zhì)譜鑒定,結(jié)果如圖2(b)所示.荷質(zhì)比為1 295.69 的肽段為α SN46-58(理論相對分子質(zhì)量為1 295.70),荷質(zhì)比為1 478.77 的肽段為α SN81-96(理論相對分子質(zhì)量為1 478.78),荷質(zhì)比為2 157.16的肽段為α SN59-80(理論相對分子質(zhì)量為2 157.0).目標蛋白實際檢測理論相對分子質(zhì)量為15 518.8,與理論相對分子質(zhì)量(15 515.7)基本一致.基于上述結(jié)果,可以確定所得目標蛋白為α SN.利用免疫點印跡法進一步驗證,結(jié)果如圖2(c)所示,重組α SN 具有較強的His 免疫原性,進一步表明目標蛋白已成功表達.
為提高目標蛋白表達量,對誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間分別進行優(yōu)化,結(jié)果如圖3(a)所示.當誘導(dǎo)溫度為37 ℃、誘導(dǎo)時間為4 h 時,目標蛋白的產(chǎn)量相對較高.因此,后期誘導(dǎo)條件選擇誘導(dǎo)溫度為37 ℃,誘導(dǎo)時間為4 h.由于利用pET22b 質(zhì)粒表達的蛋白C 端含有His 標簽,因此利用Ni-NTA 親和層析柱純化目標蛋白.對漂洗液中咪唑濃度進行優(yōu)化,結(jié)果如圖3(b)所示,當漂洗液中咪唑濃度為20 mmol/L 時純化效果最好.利用優(yōu)化好的條件,每升菌液可獲得α SN蛋白54.9 mg,純度約為96.4%(利用Image J 軟件分析).
圖3 α SN 蛋白表達及純化條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of the expression and purification of α SN
ThT 熒光染色技術(shù)常用于檢測淀粉樣蛋白的聚集特性和篩選淀粉樣蛋白聚集抑制劑[12-13].本研究同樣利用該技術(shù)來分析重組α SN 蛋白的聚集特性,并利用已知的聚集抑制劑EGCG 進一步驗證.ThT熒光實驗結(jié)果如圖4(a)所示.從該圖可以看出,α SN的ThT 曲線呈現(xiàn)典型的“S”型淀粉樣蛋白聚集曲線,共分為3 個階段:0~72 h 處于遲緩期,72 h 后進入纖維快速伸長期,96 h 后進入穩(wěn)定平臺期.當不同濃度EGCG 與α SN 共培養(yǎng)時,ThT 熒光信號強度始終較小,說明EGCG 抑制了α SN 聚集,從而導(dǎo)致其ThT 熒光信號的強度降低,與前期研究結(jié)果一致[19].
利用MTT 實驗進一步研究了重組α SN 聚集體的細胞毒性.將培養(yǎng)5 d 的α SN 聚集體與PC12 細胞共培養(yǎng),檢測細胞存活率.如圖4(b)所示,當目標蛋白與PC12 細胞共培養(yǎng)時,細胞存活率為對照組的59.47%,證明α SN 聚集形成的聚集體具有較強的細胞毒性.當?shù)葷舛菶GCG 和α SN 共同處理細胞時,細胞的存活率提高了約11%.上述結(jié)果表明EGCG 抑制了α SN 的聚集,并降低了α SN 聚集體的細胞毒性.
綜上所述,該重組α SN 具有良好的聚集性和細胞毒性,因此可應(yīng)用于篩選聚集抑制劑的研究.
圖4 重組α SN 蛋白的特征描述Fig.4 Characterization of recombinant α SN
本文開發(fā)了一種簡便、高效的α SN 表達純化方法,實現(xiàn)了該蛋白的可溶性表達.經(jīng)優(yōu)化表達及純化條件,提高了α SN 的產(chǎn)量,最終每升菌液可獲得54.9 mg,純度約為96.4%的目標蛋白.ThT 和MTT實驗進一步證明該重組α SN 具有良好的聚集性,且聚集體具有較強的細胞毒性.本研究為探索α SN 的聚集特性及篩選聚集抑制劑提供了性質(zhì)優(yōu)良的生物材料.