孫雪梅，宗 淵，楊世鵬，王麗慧，劉寶龍，張懷剛

(1.中國科學院西北高原生物研究所， 青海 西寧 810001；2.青海省作物分子育種重點實驗室，青海 西寧 810001；3.中國科學院大學，北京 100049；4.青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室， 青海 西寧 810016；5.青海大學，青海 西寧 810016)

【研究意義】果聚糖是溫帶和冷寒地區(qū)植物非結構性碳水化合物的主要貯藏方式，約12 %～15 %的被子植物中發(fā)現(xiàn)含有果聚糖，是高等植物的第三大貯藏性碳水化合物，主要存在于菊科、禾本科、百合科等植物中[1]。除了作為貯藏碳水化合物外，果聚糖在提高植物的抗寒、抗旱乃至抗鹽等方面發(fā)揮重要作用，如調節(jié)植物適應低溫光合作用[2-3]、調控植物蔗糖分配[4]以及使植物適應水分虧缺[5-6]。作為一種功能性食品，低聚合度的果聚糖是一種低熱量值的食品原料和食用甜味劑，是糖尿病和高血壓患者的良好食品和甜味劑；較高聚合度的果聚糖是一種纖維型的益生素，對人體健康有促進作用[7-8]。菊芋是商品化果聚糖的重要來源之一[9]。【前人研究進展】植物果聚糖的結構因糖苷鍵的連接方式不同和聚合度(Degree of polymerization, DP)的大小差異而相對較為復雜(Vijn等，1999)。截止目前，在植物中發(fā)現(xiàn)主要有5種類型的果聚糖，分別為菊粉型果聚糖、梯牧草型果聚糖、混合型梯牧草型果聚糖、菊粉型果聚糖新生系列和梯牧草型果聚糖新生系列，菊粉型果聚糖主要存在于菊芋、菊苣等菊科植物中，這種果聚糖是由1-SST和1-FFT共同催化，在1-SST作用下催化2個蔗糖分子形成一個1-蔗果三糖分子，在1-FFT催化下延伸1-蔗果三糖形成菊粉型果聚糖。1-SST的表達與否決定了果聚糖的形成。多個植物中的1-SST和1-FFT基因已經被克隆和功能驗證[10-13]，但關于這些基因的啟動子序列分離克隆與功能分析尚未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】啟動子作為基因表達調控的重要組成部分，控制基因表達(轉錄)的起始時間和表達程度，深入研究啟動子的結構和功能，可利用基因工程技術對植物轉基因表達進行調控。【擬解決的關鍵問題】本研究分離克隆了菊芋果聚糖合成關鍵基因1-SST的啟動子，并開展功能分析，以期為菊芋1-SST基因在轉錄水平上的表達調控機制研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗材料為青芋1號菊芋，由青海省農林科學院提供。本氏煙草由青海省作物分子育種重點實驗室提供。大腸桿菌(E.coli) 菌株TOP10 購自天根生化科技(北京) 有限公司。農桿菌GV3101 菌株購自上海生工生物工程技術公司。質粒提取試劑盒、高保真 DNA聚合酶購自Thermo公司，DNA Marker、SpeⅠ限制性內切酶、DNA 連接酶購于 NEB 公司，膠回收試劑盒，購于甘肅鵬程生物工程有限公司。

1.2 基因組DNA提取

采用CTAB-異丙醇方法，葉片液氮研磨后加CTAB提取液，65 ℃溫育30 min，之后氯仿抽提后加異丙醇沉淀。沉淀的DNA水溶解后加RNAaseA去除RNA后再乙醇沉淀，沉淀的DNA水溶備用。

1.3 PCR和Tail-PCR

PCR擴增使用高保真酶high-fidelity Phusion DNA polymerase(Thermo-Fisher Scientific)在GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)PCR擴增儀進行。PCR程序為：98 ℃ 2 min；98 ℃ 15 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。Tail-PCR根據(jù)已知的SST序列，在其5’端設計3個向外的巢式引物SP1、SP2和SP3。參照文獻設計4個隨機簡并引物AD1-4。以20 ng的基因組DNA為模板，3個特異巢式引物與任一種隨機引物進行Tail-PCR擴增(反應體系及反應條件按文獻進行)。PCR和Tail-PCR反應產物在1.0 %瓊脂糖凝膠上進行電泳分離檢測，將目的帶切膠并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒Tiangen TIANgel Midi Purification Kit(Tiangen)回收目的基因。將回收的PCR產物連接至pGEM-T Easy(Promega Corporation)載體上，轉化大腸桿菌DH5α，陽性克隆送至華大公司測序。本研究中用到的所有引物在表1中。

1.4 農桿菌介導的瞬時表達

利用重組方法將克隆到的SST基因啟動子全序列和起始密碼子上游1/2和1/4區(qū)域替換pCAMBIA1301載體上啟動GUS基因的35S啟動子。PstI和NcoI 雙酶切pCAMBIA1301載體，切除GUS基因前的35S啟動子序列，回收載體骨架后與擴增的SSTP、1/2SSTP和1/4 SSTP片段進行重組反應(vazyme公司One step cloning kit)。反應產物轉化大腸桿菌，PCR檢測陽性菌落后，選取陽性菌落提取質粒，測序確認SSTP、1/2 SSTP和1/4 SSTP已正確融合于GUS基因5’端，獲得pCAMBIA1301：SSTP1、pCAMBIA1301：SSTP2和pCAMBIA1301：SSTP3載體(圖1)。以空載體pCAMBIA1301為對照，將測序正確的載體質粒采用液氮凍融法轉化農桿菌GV3101菌株，PCR驗證后選陽性菌落備用。

挑取PCR檢驗正確的菌落接入5 mL YEP(含抗生素kan 50 mg/L+rif 25 mg/L+gen 25 mg/L)液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床(180 r/min)過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)物7000 r/min離心后收集菌體，用5 mL的重懸液(含10 mM MgCl2, 10 mM MES, 150 μM AS)重懸并室溫靜止3 h。靜置后的農桿菌(設重懸液陰性對照)注射5葉期的本氏煙草(約生長1個月)葉片，每株注射2～3個葉片，每個處理注射3株，各設3個重復。注射后的植株培養(yǎng)在25 ℃黑暗過夜后，16 h光照，8 h黑暗條件下生長。農桿菌注射后3 d，采集注射葉(2個重復)，加GUS染液37 ℃過夜染色，再用70 %的乙醇脫色(去除葉綠素)后觀察并拍照。

圖1 載體構建

表1 引物序列表

1.5 生物信息學分析

使用Vector NTI 10軟件(Invitrogen)進行序列拼接及比對。利用Primer Primer 5.0(Premier Biosoft)軟件進行引物設計。利用神經網(wǎng)絡啟動子預測分析NNPP (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html) 軟件進行啟動子核心區(qū)域生物信息學分析，在PLANTCARE網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線預測順式作用元件。

圖2 1-SST啟動子Tail-PCR擴增電泳圖

2 結果與分析

2.1 菊芋1-SST基因啟動子的分離

用CTAB-異丙醇法提取菊芋基因組DNA，經1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測合格。以基因組DNA為模板，根據(jù)獲得的核心基因組序列設計引物，通過Tail-PCR方法，分離到1816 bp的SST基因起始密碼子上游約1816 bp的序列，命名為SSTP(圖2)。

2.2 順式作用元件預測

為明晰1-SST基因很有可能參與的生物學過程，通過PLANTCARE對FFTP序列進行了生物信息學分析。SSTP序列中共檢測到140個順式作用元件，除啟動子所具備的基本元件44個TATA-box 和31個CAAT-box之外，尚有65個參與1-SST基因表達調控的順式作用元件。在65個順式作用元件中，23個順式作用元件能夠預測其功能。參與光調控的13個，脫落酸、厭氧過程、低溫脅迫的調控元件各2個，水楊酸、抗逆反應、分生組織表達和胚乳表達的元件各1個(表2)。

2.3 瞬時表達研究啟動子活性

為研究SST基因啟動子的核心區(qū)域，分別用SSTP1(啟動子全長)、SSTP2(1/2全長)和SSTP3(1/4全長)的序列替換pCAMBIA1301載體的CaMV 35S啟動子獲得載體pCAMBIA1301：SSTP1、pCAMBIA1301：SSTP1和pCAMBIA1301：SSTP3，并將pCAMBIA1301：SSTP1、pCAMBIA1301：SSTP2和pCAMBIA1301：SSTP3和pCAMBIA1301轉化農桿菌GV3101后，在煙草葉片進行瞬時表達。GUS染色后發(fā)現(xiàn)，對照CaMV 35S、SSTP1、SSTP2和SSTP3均具有驅動GUS基因表達的啟動子活性，且活性與CaMV35S相當(圖3)。

表2 SSTP區(qū)域具有功能注釋的順式作用元件特征

3 討 論

啟動子是基因表達調控的順式元件，啟動子的克隆與功能分析可以為基因表達調控、構建基因工程載體，表達目的蛋白，探討基因表達調控機制等提供理論依據(jù)。該研究通過Tail-PCR方法得到了1-SST基因起始密碼子上游約1816 bp的啟動子序列，通過瞬時表達的方法初步推斷了啟動子核心區(qū)域1-SST基因起始密碼子400 bp以內。PLANTCARE分析表明，克隆到的啟動子除含有多個TATA-box、CAAT-box 等基本啟動子元件，還含有參與光調控、脫落酸、厭氧過程、低溫脅迫及抗逆反應的調控元件。前期有研究表明，果聚糖積累可以使植物在多種環(huán)境脅迫下的抗逆性增強，如低溫和干旱引起的缺水[14]、缺氧[15]、鹽害[16]等。

圖3 不同處理GUS染色后的煙草葉片

4 結 論

本研究進一步驗證了果聚糖合成酶基因1-SST可能參與植物的抗逆生理過程。此外果聚糖的合成積累都在植物的根部，該組織與其他組織相比，弱光是其主要特征，因此在SST區(qū)域中存在較多的光反應與調控元件。