王 卓，史美華，宋文騰，馬自飛，路文靜，肖 凱

(1.河北農業(yè)大學 生命科學學院， 河北 保定071001; 2.河北農業(yè)大學 農學院， 河北 保定071001)

植物生長發(fā)育過程中，細胞內部鈣離子作為第二信使，通過細胞微管骨架調節(jié)，參與各種細胞內部和環(huán)境信號的傳遞、整合和倍增傳導，啟動信號途徑中下游基因的轉錄［1］。研究表明，真核生物種屬細胞內部的鈣調素(CaM) 家族成員，具有感受生物及非生物逆境信號誘發(fā)的鈣離子振蕩能力［2］，廣泛參與各種生物和非生物逆境信號的轉導過程，在介導植株抵御外界脅迫中發(fā)揮重要作用［3-5］。

干旱、鹽害及養(yǎng)分缺乏等非生物脅迫誘發(fā)植物細胞膜滲透壓提高，增高的膜滲透壓進一步激活G蛋白和磷脂酶介導的磷酸化反應，參與鈣離子通道活化、胞質內鈣離子濃度增加和引發(fā)振蕩鈣信號過程［6-7］。研究發(fā)現，逆境誘發(fā)的鈣信號振幅及時空表現特征與植株遭受的逆境及脅迫程度密切相關［8］。CaM作為細胞中重要Ca2+受體，與其他鈣離子結合蛋白協(xié)同作用，引發(fā)特定的鈣信號轉導通路，參與植株生長發(fā)育的調節(jié)以及對逆境的響應和抵御過程［9］。近年來研究表明，礦質營養(yǎng)缺乏誘發(fā)細胞中Ca2+濃度變化及啟動鈣信號轉導通路，在細胞和分子水平上誘導系列逆境應激反應，與CaM的介導具有緊密聯系［10-11］。因此，深入闡明CaM家族成員與作物抵御非生物逆境之間的內在機理，對于作物抗逆遺傳改良具有重要指導意義。

盡管迄今有關模式植物CaM家族成員分子特征及耐逆功能已有較多報道［12-14］，但有關小麥鈣調素介導植株發(fā)育和應答非生物逆境的研究仍相對較少。磷素是作物植株必需大量營養(yǎng)元素，提高小麥等重要農作物的磷素吸收和利用能力，對于促進我國的農業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要實踐意義［15］?；诖耍菊n題組以前期鑒定的1個對低磷逆境產生應答的小麥CaM家族成員TaCaM1為基礎，對該基因分子特征、應答低磷逆境表達模式及介導植株抵御低磷脅迫的能力進行了較系統(tǒng)研究，旨在深入揭示鈣調素調控小麥抵御養(yǎng)分脅迫分子機制，為今后小麥磷高效遺傳改良提供依據。

1 材料與方法

1.1 TaCaM1核苷酸水平系統(tǒng)進化分析

作者前期利用RNA-seq進行小麥（cv.石新828）應答低磷脅迫的轉錄譜分析中，鑒定了1個對低磷逆境應答、歸屬于鈣調素家族的基因，本文將其命名為TaCaM1（GenBank登錄號AK456183）。以該基因cDNA序列為基礎在NCBI網站上對其同源基因進行BLAST同源查找，獲得與該基因序列同源的不同植物種屬家族成員。利用MEGA7軟件，構建TaCaM1與其植物種屬同源基因的系統(tǒng)進化樹，明確TaCaM1的系統(tǒng)進化特征。

1.2 TaCaM1蛋白特征分析

利用 ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）在線工具，獲得TaCaM1編碼氨基酸序列；利用NCBI蛋白分析工具鑒定TaCaM1蛋白的保守結構域。為明確供試基因編碼蛋白的亞細胞定位特征，利用DNA重組技術，構建融合蛋白TaCaM1-GFP（綠色熒光蛋白）表達載體，擴增該基因的正向引物為5′-AAAGTCGACATATGGCGGA CCAGCTCACC-3′，反向引物為 5′-AAAGGTACC CTTGGCCATCATCACCTT-3′。將構建表達載體轉化感受態(tài)農桿菌EHA105，鋪平板后挑取陽性克隆搖菌，LB振蕩培養(yǎng)后至OD值0.4，用注射器將菌液注射煙草表皮細胞，培養(yǎng)48 h后撕取轉化葉片表皮細胞，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光蛋白定位，進而明確供試基因編碼蛋白的亞細胞定位特征。

1.3 TaCaM1應答低磷逆境表達特征

在生長室內，參照課題組建立的方法正常水培小麥（cv.石新828）至三葉期（溶液含磷1.2 mmol/L Pi）。然后，將幼苗轉移至含磷量降低的低磷（10 μmol/L Pi）溶液內進行低磷處理。在低磷處理后1、3、9和27 h，收獲根系樣本。此外，為揭示供試基因對復磷響應特征，將部分低磷處理后27 h幼苗再度轉移至正常含磷營養(yǎng)液內，復磷后1、3、9和27 h，收獲根系樣本。以低磷處理前正常幼苗根系（0 h）作對照。采用qRT-PCR鑒定不同供磷處理及測試時間點的TaCaM1轉錄本數量。擴增供試基因的正向引物為，5′-AGAACACTGTTGTAAGGCTCAAC-3′， 反 向引物為 5′-GAGCTTTACTGCCTCGAACATGG-3′。q-RTPCR具體操作過程參照Guo等［12］的方法進行。采用組成型小麥基因Tatubulin作為供試基因轉錄本均一化內參，擴增該內參基因正向引物為：5′-AGAACACTGTTGTAAGGCTCAAC-3′，反向引物為：5′-GAGCTTTACTGCCTCGAACATGG-3′。

1.4 不同供磷處理下TaCaM1轉化株系植株形態(tài)和鮮干重測定

利用基因重組技術，構建融合TaCaM1基因正、反義序列的雙元表達載體，采用農桿菌介導法，建立正義和反義表達供試基因的煙草轉化株系，具體過程參照Sun等［16］的方法進行。其中，擴增TaCaM1正義序列的正向引物為，5′-AAAC CATGGAGTAGGTAGCTATGCTCC-3′， 反 向 引 物為 5′-AAAGGTTACCTAGCTTAGTATGGC-3′；擴增TaCaM1反義序列的正向引物為，5′-AAACCATGGCAGCTCACTTGGCC-3′，反向引物為 5′-AAAGGTAACCAGCTCACCGACGAC-3′。

以獲得的正義株系Sen-1、反義株系Anti-1和未遺傳轉化的野生型（WT）為材料，采用含有豐磷（1.2 mmol/L Pi）和低磷（10 μmol/L Pi）的 MS 營養(yǎng)液培養(yǎng)供試材料。其中，每3 d更換1次營養(yǎng)液。處理后14 d，對不同磷處理下供試材料照相，記錄植株生長情況。同時，選取不同供磷處理下各材料植株，測定根系和葉片鮮重。進一步將樣本在烘箱內烘干，獲得供試材料干重。

1.5 不同供磷處理下TaCaM1轉化株系植株含磷量和磷累積量測定

以上述不同供磷處理后的轉化株系（正義系Sen-1和反義系Anti-1）和野生型植株為材料，參照Guo等［12］采用的磷鉬黃比色法，測定供試材料根系和葉片的含磷量。通過各供試材料根系和葉片含磷量與對應器官的干重乘積，獲得不同供磷處理下的器官磷累積量。

1.6 不同供磷處理下TaCaM1轉化株系植株細胞保護酶活性和丙二醛含量測定

同樣，以上述不同供磷處理后的轉化株系（正義系Sen-1和反義系Anti-1）和野生型植株為材料，參照Huang等［17］的方法，測定供試材料根葉超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫（CAT）活性、過氧化物酶（POD）活性以及細胞膜質過氧化產物丙二醛（MDA）含量。

1.7 數據統(tǒng)計學分析

采用Microsoft Excel 2003和DPS 7.05軟件進行數據處理和統(tǒng)計分析。各測定數據均源于3次測試重復結果。

2 結果與分析

2.1 TaCaM1基因分子特征

TaCaM1基因編碼149個氨基酸，編碼蛋白分子量16 831.67，等電點為4.11。系統(tǒng)進化分析表明，TaCaM1與已報道的小麥（T.aestivum）、水稻（O.sativa）、大豆（G.max）、甘蔗（S.officinarum）等種屬的CaM家族基因在核苷酸水平高度同源（圖1）。表明TaCaM1可能具有上述同源基因具有相似的進化途徑和相近的生物學功能。

圖1 TaCaM1的系統(tǒng)進化特征Fig.1 Phylogenetic characteristic of TaCaM1

蛋白保守域分析表明，TaCaM1基因編碼蛋白含有與 EH、EFh superfamily、EF-hind 4 superfamily和EF-hand 7 superfamily家族相似的鈣離子結合保守域EF-hand（圖2A）。表明TaCaM1具有結合特定信號誘發(fā)的鈣離子能力。亞細胞定位試驗證實，經內質網分選后，TaCaM1編碼蛋白定位在細胞質（圖2B）。表明TaCaM1主要在細胞質中參與結合鈣離子及信號的轉導。

圖2 TaCaM1的保守結構域及亞細胞定位特征Fig.2 Characterization of the conservative domains and subcellular localization of TaCaM1

2.2 TaCaM1基因應答低磷逆境表達模式

表達分析表明，低磷脅迫下，植株體內的TaCaM1轉錄本豐度降低，在27 h處理時間表現為隨著處理進程，該基因的表達水平不斷下降。將低磷處理27 h植株轉入豐磷進行復磷處理后，該基因的轉錄本數量增多，且在27 h復磷處理下表現為隨著處理進程表達水平不斷增高的特征（圖3）。上述結果表明，TaCaM1對低磷逆境呈依賴處理時間的下調表達模式，通過應答低磷逆境，參與介導植株抵御低磷逆境的過程。

圖3 TaCaM1應答低磷脅迫的表達模式Fig.3 Expression patterns of TaCaM1 upon low-P stress conditions

2.3 低磷處理下TaCaM1轉化株系生長特征

豐磷對照條件下，與野生型（WT）相比，轉化株系Sen-1和Anti-1的植株長勢、植株鮮重和植株干重沒有明顯差異（圖4A-4C）。

圖4 不同磷水平下TaCAM1轉化株系表型和鮮干重Fig.4 Phenotypes, fresh weights, and dry weights of the transgenic lines of TaCaM1 under different P level treatments

低磷處理下，與WT相比，Sen-1株系的植株長勢減弱，植株鮮干重顯著降低；但Anti-1株系的植株長勢明顯增強，植株鮮干重顯著增加（圖4A-4C）。上述結果表明，TaCaM1在介導植株抵御低磷脅迫中發(fā)揮重要的負調控效應。

2.4 低磷處理下TaCaM1轉化株系植株磷素吸收特征

對不同供磷處理下的轉化株系研究表明，與WT相比，供試轉化株系的根、葉含磷量和磷累積量在豐磷條件下無明顯差異（圖5）。但在低磷處理下，轉化株系Sen-1的根、葉磷累積量較WT顯著減少，Anti-1的根、葉磷累積量較WT顯著增多（圖5）。因此，低磷處理下轉化株系中植株磷累積量受到TaCaM1的明顯調節(jié)，進而改變的植株磷素吸收特性參與轉化株系低磷處理下植株長勢和干物質生產的調控。

圖5 不同磷水平下TaCaM1轉化株系的含磷量和磷累積量Fig.5 P concentrations and P accumulative amounts of the transgenic lines of TaCaM1 under different P level treatments

2.5 低磷處理下TaCaM1轉化株系植株細胞保護酶活性和丙二醛含量

增強細胞活性氧清除能力在改善植株抵御非生物逆境過程中發(fā)揮重要功能。為明確TaCaM1介導植株抵御低磷逆境與細胞活性氧代謝的關系，對不同供磷處理下轉化株系的細胞保護酶活性和膜質過氧化產物數量進行了測定。結果表明，豐磷對照條件下，與WT相比，供試轉化株系的SOD、CAT和POD活性及MDA含量表現相近（圖6）。低磷處理下，轉化株系Sen-1的SOD和CAT活性較WT顯著降低（圖6A-B），MDA含量增多（圖6D）；Anti-1的SOD和CAT活性則較WT顯著增強（圖6A-B），MDA含量減少（圖6D）。上述結果表明，TaCaM1通過調控低磷逆境下的細胞活性氧清除能力，參與該基因介導的植株低磷脅迫抵御過程。

圖6 不同磷水平下TaCaM1轉化株系的細胞保護酶活性和丙二醛含量Fig.6 Antioxidant enzyme activities and MDA contents of the transgenic lines of TaCaM1 under different P level treatments

3 討論與結論

鈣調素（CaM）是一類重要鈣離子信號感受器，與Ca2+相互作用后，CaM發(fā)生構象改變，參與植株體內特定激酶和磷酸酶活性的調節(jié)，介導鈣信號通路的信號傳遞［3］。本研究對小麥TaCaM1分子特征研究表明，該基因與植株種屬部分CaM家族成員在核苷酸水平上高度同源，且其編碼蛋白具有結合鈣離子的保守結構域EF-hand。因此，該基因是小麥種屬中的CaM家族基因，通過特異結合特定信號啟動的震蕩鈣離子，參與植株生長發(fā)育和逆境應答及抵御過程。

通過在轉錄水平上應答特定逆境，細胞信號轉導通路中信號分子編碼基因在調控植株對逆境的適應過程中發(fā)揮重要生物學功能［18］。本研究表明，TaCaM1呈典型的低磷下調表達模式，在表達上表現為隨著低磷處理進程，基因轉錄本不斷減少；將低磷處理后植株轉入豐磷進行復磷處理后，該基因的表達水平不斷得到恢復。表明TaCaM1通過在轉錄水平上對低磷逆境應答，參與植株抵御低磷逆境的生物學過程。進一步揭示TaCaM1應答低磷的轉錄調控機制，將有助于闡明重要信號分子響應低磷脅迫的分子機理。

目前，前人已對擬南芥、水稻、大豆等植物種屬中已有部分對CaM家族成員抵御各種非生物逆境功能進行了研究。熱激作用下，擬南芥AtCaM3顯著增強植株的抗熱能力［12］；水稻CaM家族基因OsCaM1-1在增強植株抵御滲透脅迫和鹽分脅迫中發(fā)揮重要功能［13］；大豆GmCaM4通過誘導轉錄，明顯改善植株的抗病性和耐鹽能力［14］。對CaM家族成員耐逆分子機制研究發(fā)現，擬南芥AtCaM介導的植株抗旱能力增強，其與鈣離子組建Ca2+/CaM復合體、進而作為三螺旋轉錄開關啟動響應滲透脅迫和氣孔關閉相關基因轉錄、降低水分散失、進而提高植物水分利用效率有關［19］。本研究通過轉化株系，對TaCaM1介導植株抵御低磷逆境的功能進行了研究，結果表明，該基因通過調控細胞保護酶活性，影響低磷逆境下的細胞膜質過氧化程度，進而參與植株磷素吸收和干物質生產能力的調控。與野生型對照相比，反義表達TaCaM1的株系低磷逆境下細胞保護酶SOD和CAT活性增強，丙二醛含量降低，磷累積量顯著增多，植株干物質生產能力明顯改善。因此，TaCaM1作為植株低磷響應負調控因子，在介導植株抵御低磷逆境過程中發(fā)揮重要生物學功能。該基因在今后小麥磷效率評價及磷高效遺傳改良中具有重要的應用價值。