張馨月 高西 許飏

皮膚惡性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma，CMM)是皮膚科常見(jiàn)的一種起源于外胚層神經(jīng)嵴皮膚黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)率和病死率較高，預(yù)后較差[1]。CMM在不同國(guó)家、地區(qū)及人種中的發(fā)病率有較大差異，其與惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)家族史、紫外線(xiàn)照射、創(chuàng)傷等具有較大關(guān)系。有報(bào)道顯示，CMM發(fā)病率占皮膚惡性腫瘤的5%左右，但占MM的90%，在皮膚惡性腫瘤中病死率最高，其病死率和發(fā)病率每年呈上升趨勢(shì)，且對(duì)傳統(tǒng)的化療、放療等治療手段不敏感，因此，尋找CMM治療新靶點(diǎn)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)及難度[2,3]。微小RNA(microRNA，MiRNA)是當(dāng)今分子生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但關(guān)于MiR-767在CMM的研究還較少，圓柱瘤基因(CYLD)是一種抑癌基因，具有去泛素化酶作用，在腫瘤疾病中能夠通過(guò)對(duì)核因子-κB(NF-κB)、JNK等信號(hào)通道參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等過(guò)程[4,5]。因此，本研究旨在探討MiR-767和CYLD在CMM中的表達(dá)情況及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年7月至2013年10月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院和西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理確診的CMM患者45例，采集患者腫瘤組織及其配對(duì)的瘤旁正常組織進(jìn)行研究。其中男28例，女17例；年齡32～68歲，平均年齡(51.37±5.53)歲；按照AJCC中CMM TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期7例，Ⅱ期13例，Ⅲ期19例，Ⅳ期6例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)組織病理學(xué)確診為CMM；②患者年齡≥18歲；③患者對(duì)本研究知情，自愿參與并簽署知情同意書(shū)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組前有手術(shù)、放化療、免疫治療史者；②合并糖尿病、高血壓等嚴(yán)重慢性疾病者；③合并其他惡性腫瘤者；④多方面確診預(yù)測(cè)生存期<3個(gè)月者；⑤妊娠期或哺乳期患者；⑥合并血液性疾病及免疫抑制性疾病者。

1.3 樣本收集 收集患者術(shù)后切除的腫瘤組織及對(duì)應(yīng)的瘤旁正常組織，無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液清漂洗殘留血跡，液氮保存，再轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試劑與儀器 Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇購(gòu)自晶美生物工程有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ultra SYBR Mixture購(gòu)自北京康為生物科技有限公司，MyCycler PCR儀購(gòu)自美國(guó)BIORAD公司，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(Light Cycler)購(gòu)自美國(guó)羅氏公司，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)GENE公司，PCR引物由上海生工公司合成。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 總RNA提取：取組織樣本加液氮研磨至粉末置于離心管中，加入Trizol (每50～100毫克樣本加Trizol 100 ml)，提取RNA，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度及純度，RNA純度高，無(wú)降解、無(wú)DNA污染方可用于cDNA合成。

1.5.2 逆轉(zhuǎn)錄合成:冰上配制，反應(yīng)體系為：10×g DNA Eraser Buffer 1 μl，gDNA Eraser 0.5 μl，RNA 模板 1.5 μl，RNase -free ddH2O 8 μl，漩渦混合器混勻，放入金屬浴中65℃預(yù)熱5 min，短暫離心，冰上冷卻加入：HiFiScript 10 μl，Prime Mix 1 μl，5×ScriptRT Buffer 4 μl，RNase RNase -free ddH2O 4 μl，PCR反應(yīng)條件：42℃，40 min；85℃，5 min；引物-20℃保持備用。

1.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè):以U6、GAPDH做內(nèi)參基因，以逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA為模板，反應(yīng)體系：2×Ultra SYBR Mixture 7.5 μl，cDNA 1 μl，F(xiàn)orward Priner 0.31 μl，Reverse Priner 0.3 μl，RNase -free ddH2O 5.9 μl，反應(yīng)總體積15 μl，做3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性,10 min；95℃變形，15 s；60℃退火，1 min；50個(gè)循環(huán)，72℃，30 s。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用2-CT方法計(jì)算 MiR-767和CYLD的相對(duì)定量。見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果

2.1 MiR-767和CYLD表達(dá)水平比較 腫瘤組織中MiR-767表達(dá)水平明顯高于瘤旁正常組織(P<0.05)，CYLD表達(dá)水平顯著低于瘤旁正常組織(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 CMM中MiR-767和CYLD表達(dá)與臨床病理特征之間關(guān)系 以CMM中MiR-767和CYLD表達(dá)的中位數(shù)(3.28,0.41)為界值將CMM患者分成MiR-767高表達(dá)組(n=24)、低表達(dá)組(n=21)，CYLD高表達(dá)組(n=18)、低表達(dá)組(n=27)。MiR-767表達(dá)與性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤厚度密切相關(guān)(P<0.05)，CYLD表達(dá)與性別、腫瘤分期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤厚度密切相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

組別MiR-767CYLD瘤旁正常組織0.86±0.280.73±0.22腫瘤組織 5.37±0.520.11±0.06t值51.22618.239P值<0.001<0.001

表3 CMM中MiR-767和CYLD表達(dá)與臨床病理特征之間關(guān)系 例

2.3 MiR-767與CYLD表達(dá)相關(guān)性 隨著CMM腫瘤組織中MiR-767表達(dá)水平升高，CYLD表達(dá)呈明顯降低趨勢(shì)，MiR-767與CYLD表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=0.791，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 MiR-767與CYLD表達(dá)相關(guān)性

2.4 CMM Kaplan-Meier生存分析 MiR-767高表達(dá)組預(yù)后5年存活率為12.50%，MiR-767低表達(dá)組預(yù)后5年存活率為33.33%，MiR-767高表達(dá)組存活率顯著低于低表達(dá)組存活率，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.690，P=0.030)。CYLD高表達(dá)組預(yù)后5年存活率為38.89%，CYLD低表達(dá)組預(yù)后5年存活率為14.81%，CYLD高表達(dá)組存活率顯著高于低表達(dá)組存活率，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.072，P=0.044)。見(jiàn)圖2、3。

圖2 MiR-767高表達(dá)組與低表達(dá)組生存曲線(xiàn)比較

圖3 CYLD高表達(dá)組與低表達(dá)組生存曲線(xiàn)比較

2.5 CMM預(yù)后的多因素回歸分析 經(jīng)COX多因素分析顯示，性別對(duì)CMM患者預(yù)后無(wú)明顯影響(P>0.05)；腫瘤分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤厚度、MiR-767是影響CMM患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，CYLD是影響CMM患者預(yù)后的保護(hù)因素(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 影響CMM預(yù)后的多因素回歸分析

3 討論

隨著人們生活習(xí)慣、環(huán)境等的改變，CMM已成為中國(guó)發(fā)病率增殖最快的惡性腫瘤之一，對(duì)同時(shí)也是侵襲性最快的皮膚惡性腫瘤，對(duì)機(jī)體任何器官幾乎都能夠進(jìn)行侵襲[6]。CMM的多發(fā)部位為頭面部、背部、四肢及肢端等部位，CMM早期主要癥狀為黑色素痣快速變大、邊緣界限不明顯、顏色不均勻、瘙癢等，早期易被當(dāng)做黑色素痣不被重視，早期發(fā)現(xiàn)經(jīng)手術(shù)及放化療治愈率可達(dá)90%～95%，但一旦發(fā)展到晚期出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、衛(wèi)星灶等治愈率較低，有調(diào)查顯示中國(guó)CMM患者5年生存率低于20%[7,8]。因此，尋求CMM治療的新靶點(diǎn)成為提高CMM患者生存率的關(guān)鍵。

miRNA是一類(lèi)高度保守的非編碼小分子RNA，研究發(fā)現(xiàn)1%～3%的miRNA基因組可對(duì)人類(lèi)高達(dá)30%的基因進(jìn)行調(diào)控，已成為現(xiàn)代生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。miRNA主要通過(guò)對(duì)信使RNA(mRNA)翻譯干擾來(lái)調(diào)控下游相關(guān)靶基因表達(dá)，已有研究證實(shí)miRNA與早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化、腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡、血管生成、炎癥過(guò)程等都有密切聯(lián)系[9,10]。Yang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-124能夠通過(guò)抑制多功能蛋白聚糖抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。陳瑤等[12-14]研究顯示，miR-25在MM患者腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)調(diào)控下游靶基因促進(jìn)黑色素細(xì)胞增殖及侵襲。本研究結(jié)果顯示，CMM腫瘤組織中MiR-767表達(dá)水平明顯高于瘤旁組織，CYLD表達(dá)水平顯著低于瘤旁組織這與Zhang等[15]研究基本相一致，表明CMM患者腫瘤組織中MiR-767表達(dá)上調(diào)，CYLD表達(dá)下調(diào)。經(jīng)病理特征之間的關(guān)系比較發(fā)現(xiàn)，MiR-767表達(dá)與性別無(wú)明顯關(guān)系，與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤厚度關(guān)系密切，CYLD表達(dá)與性別、腫瘤分期無(wú)明顯關(guān)系，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤厚度密切相關(guān)。說(shuō)明MiR-767與CYLD可能參與CMM腫瘤細(xì)胞增殖、遷移的過(guò)程，同時(shí)有可能成為CMM治療的新靶點(diǎn)。通過(guò)Pearson相關(guān)性分析顯示，隨著CMM腫瘤組織中MiR-767表達(dá)水平升高，CYLD表達(dá)呈明顯降低趨勢(shì)，MiR-767與CYLD表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明在CMM患者體內(nèi)MiR-767高表達(dá)能夠抑制CYLD基因表達(dá)，引起患者發(fā)病。CYLD是新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因，在多種腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，CYLD去泛素化活性能夠?qū)F-κB、WNT/β-catenin、JNK等信號(hào)通路發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用，在調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)及腫瘤發(fā)生等發(fā)揮重要作用[16]。倪芳等[17]研究發(fā)現(xiàn)CYLD，在肝癌細(xì)胞中低表達(dá)，低表達(dá)的CYLD激活了NF-κB信號(hào)通路，肝癌細(xì)胞明顯增殖。Hayashi等[18]研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中CYLD顯著降低，并且通過(guò)下調(diào)CYLD表達(dá)能夠活化NF-κB信號(hào)途徑來(lái)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。在CMM腫瘤細(xì)胞中，MiR-767可能是通過(guò)其表達(dá)上調(diào)抑制CYLD表達(dá)，而CYLD蛋白上存在能使κB去泛素化的結(jié)合位點(diǎn)，CYLD表達(dá)降低使κB去泛素化減少，而κB是NF-κB信號(hào)途徑中關(guān)鍵抑制蛋白，因此，NF-κB信號(hào)途徑被激活，引起CMM腫瘤細(xì)胞增殖及遷移。生存曲線(xiàn)分析顯示，MiR-767高表達(dá)患者5年生存率低于低表達(dá)患者，CYLD高表達(dá)患者5年生存率高于低表達(dá)患者，說(shuō)明可通過(guò)對(duì)MiR-767與CYLD表達(dá)水平檢測(cè)判定CMM患者預(yù)后情況。經(jīng)COX多因素分析顯示，性別對(duì)CMM患者預(yù)后無(wú)明顯影響；腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤厚度、MiR-767是影響CMM患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，CYLD是影響CMM患者預(yù)后的保護(hù)因素，提示可通過(guò)對(duì)MiR-767與CYLD靶向治療延長(zhǎng)CMM患者預(yù)后生存時(shí)間。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)CMM腫瘤組織中MiR-767和CYLD水平檢測(cè)顯示，CMM患者腫瘤組織中MiR-767表達(dá)上調(diào)，CYLD表達(dá)下調(diào)，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，MiR-767與CYLD表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，為CMM患者靶向治療提供新思路，同時(shí)可作為CMM預(yù)后潛在的檢測(cè)指標(biāo)。