文景芝，趙鈺琦，高新穎，張卓群，吳羚閣，賈夢瑱

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

大豆疫霉（Phytophthora sojaeKauf.&Gerd.）是大豆（Glycine maxL.）生產(chǎn)中最具破壞性的植物病原生物之一，引起大豆疫霉根腐病，嚴重限制大豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展并產(chǎn)生巨大損失[1]。大豆疫霉是土傳病原卵菌，寄主范圍窄，自然條件下僅侵染大豆，其他條件下也侵染羽扇豆（Lupinus micranthusGuss）[2]。防治大豆疫霉根腐病最有效方法是選育抗病品種，因此了解大豆抗病機制尤為重要。

種子分泌物在種子際中發(fā)揮重要作用。種子分泌物瞬時釋放在很大程度上控制種子際病原物群落動態(tài)變化，對種子際病原物生長和發(fā)育產(chǎn)生重要影響[3]。種子分泌物是天然的生物活性化合物，由復(fù)雜的混合物組成，包括糖類、氨基酸類、黃酮類、酚酸類，還有一些肽類和蛋白質(zhì)等。研究表明，種子分泌物中的營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸和糖為病原物生長和孢子萌發(fā)提供能量，促進病原物侵染寄主[4]。而其中一些肽類、蛋白質(zhì)和次生代謝物質(zhì)抑制土傳病原物活性從而阻止其侵染，與植物抗病性有關(guān)[5]。

種子分泌物對病原物的抑制作用研究較多，如羽扇豆種子分泌物中幾丁質(zhì)酶可有效抑制病原真菌生長[6]；豇豆（Vigna unguiculata）種子分泌物中鑒定得到抗真菌蛋白如β-1,3 葡聚糖酶、胱蛋白、豌豆球蛋白和脂轉(zhuǎn)移蛋白[7]；大豆分泌大量蛋白酶抑制劑和其他蛋白質(zhì)，在大豆防御病原物過程中有潛在作用。已報道大豆種子分泌物中蛋白質(zhì)包括凝集素、胰蛋白酶抑制劑和脂氧合酶等對南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）有防御活性[5]。但大豆種子分泌物中蛋白質(zhì)對大豆疫霉防御作用尚不清楚。

本試驗將利用LC/MS-MS技術(shù)鑒定大豆抗、感品種接種前后種子分泌物中蛋白質(zhì)種類，重點比較大豆疫霉接種后誘導(dǎo)表達的差異蛋白。通過測定大豆抗、感品種接種前后種子分泌物中蛋白質(zhì)對大豆疫霉游動孢子趨化性、成囊、萌發(fā)的影響，明確其防御活性。本研究有助于了解大豆種子分泌物中蛋白質(zhì)在大豆疫霉防御中的作用，鑒定抗病相關(guān)蛋白，為利用寄主抗病性防治大豆疫霉根腐病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

增強型綠色熒光蛋白標(biāo)記大豆疫霉菌株Eps597-3，致病型為1a, 3c, 7。大豆感病品種Sloan，不含任何已知抗大豆疫霉根腐病基因，可被大豆疫霉任何生理小種侵染；大豆抗病品種Williams 82，含有Rps1k基因，對供試菌株Eps597-3表現(xiàn)抗病。

1.2 游動孢子懸浮液制備

參照文景芝等方法[8]。

1.3 收集種子分泌物

接種前收集種子分泌物：選取飽滿、無破損的2個供試品種種子各10 g，具體操作參照文景芝等方法[8]。

接種后收集種子分泌物：方法與接種前大致相同，但在25 ℃黑暗條件下吸脹12 h 后補加游動孢子懸浮液（濃度為1 g 種子對應(yīng)1 mL 游動孢子懸浮液），繼續(xù)在黑暗條件下浸泡36 h，移出種子，期間補加超純水至10 mL，收集種子分泌物溶液并過濾除菌。

1.4 種子分泌物中蛋白質(zhì)提取

采取硫酸銨沉淀法提取蛋白質(zhì)[9]，蛋白質(zhì)沉淀經(jīng)過透析除鹽后測定活性。采用MWCO3500 透析袋，透析48 h（4 ℃）。

1.5 種子分泌物中蛋白質(zhì)對大豆疫霉游動孢子趨化性的影響

趨化性試驗參照Suo等方法[10]。取充滿2 μL蛋白質(zhì)溶液（10 mL 種子分泌物中提取出的蛋白質(zhì)沉淀，回溶于50 mL超純水中，使其相對濃度為1：5）的毛細管插入趨化性測定室一端，另一端插入充滿2 μL 超純水的毛細管為對照。記錄5、15、25 min時兩只毛細管中游動孢子數(shù)量，觀察大豆疫霉游動孢子對種子分泌物中蛋白質(zhì)的趨化性。試驗時室內(nèi)溫度25 ℃，各處理3次技術(shù)重復(fù)，試驗3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 種子分泌物中蛋白質(zhì)對大豆疫霉游動孢子成囊的影響

取新鮮孢子懸浮液300 μL 加入離心管中，向離心管中加入蛋白質(zhì)溶液200 μL（10 mL 種子分泌物中提取蛋白質(zhì)沉淀回溶于20 mL超純水中，使其相對濃度為1：2）混合均勻。取100 μL 加入凹玻片中，以等量超純水為空白對照。記錄0.5、1、2 h時各處理游動孢子成囊率。各處理3 次技術(shù)重復(fù)，試驗3次生物學(xué)重復(fù)。

1.7 種子分泌物中蛋白質(zhì)對大豆疫霉孢囊萌發(fā)的影響

孢囊萌發(fā)試驗參照文景芝等方法[8]。向游動孢子懸浮液中加入蛋白質(zhì)溶液250 μL（終濃度與試驗1.6 相同），以等量超純水為空白對照。分別記錄8、9、10 h時各處理孢囊萌發(fā)率。各處理3次技術(shù)重復(fù)，試驗3次生物學(xué)重復(fù)。

1.8 LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定

1.8.1 酶解

蛋白質(zhì)酶解參考Katayama等方法[11]。

1.8.2 質(zhì)譜操作及數(shù)據(jù)庫檢索

Nano-RPLC Buffer A 溶解多肽樣品。在線Nano-RPLC 液相色譜在Eksigent nanoLC-UltraTM2D系統(tǒng)（AB SCIEX）完成，2 μL·min-1流速上樣C18預(yù)柱上（100 μm×3 cm，C18,3 μm,150 ?），保持流速沖洗脫鹽10 min。分析柱為C18反相色譜柱（75 μm×15 cm C18-3 μm 120 ?, ChromXP Eksigent），試驗所用梯度為90 min 內(nèi)流動相B 由5%升至35%。質(zhì)譜采用TripleTOF5600 系統(tǒng)（AB SCIEX）結(jié)合納升噴霧III 離子源（AB SCIEX，USA），噴霧電壓為2.5 kV，氣簾氣壓為30 PSI，霧化氣壓為5 PSI，加熱器溫度為150 ℃，質(zhì)譜掃描方式為信息依賴采集工作模式（IDA，Information Dependent Analysis），一級TOF-MS單張圖譜掃描時間為250 ms，每次循環(huán)時間固定為2.5 s，碰撞室能量設(shè)定適用于所有前體離子碰撞誘導(dǎo)解離（CID），動態(tài)排除設(shè)置為18 s。數(shù)據(jù)處理采用Mascot 2.3 軟件（Matrix Science），數(shù)據(jù)庫為NCBI 數(shù)據(jù)庫，允許最大漏切位點為2；固定修飾為：Carbamidomethyl（C）；可變修飾為：Acetyl（Protein N-term）、Deamidated（NQ）、Dioxidation（W）、Oxidation（M）、Phospho（ST）和Phospho（Y）；MS 容差為±15 ppm，MSMS 容差為±0.15 u，Protein score C.I.%大于95%為鑒定成功。

1.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2016（Microsoft Corporation，Washington D.C，USA）和SPSS 25.0 處理數(shù)據(jù)并統(tǒng)計分析。各試驗3次生物學(xué)重復(fù)數(shù)據(jù)作平均值及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆種子分泌物中蛋白質(zhì)對大豆疫霉游動孢子的趨化作用

接種前大豆感病品種Sloan 種子分泌物中蛋白質(zhì)顯著吸引大豆疫霉游動孢子，接種后卻轉(zhuǎn)而排斥大豆疫霉游動孢子。大豆抗病品種WillIams 82接種前后種子分泌物中蛋白質(zhì)均對大豆疫霉游動孢子產(chǎn)生排斥作用，且接種后排斥作用更強，但差異不顯著（見圖1A）。

2.2 大豆種子分泌物中蛋白質(zhì)對大豆疫霉游動孢子成囊的影響

大豆感病品種Sloan 接種前后種子分泌物中蛋白質(zhì)均促進大豆疫霉游動孢子成囊，且接種后促進作用顯著增強，特別是處理0.5 h 時，促進指數(shù)高達9.3，顯著高于其他時段。大豆抗病品種Williams 82 接種前后種子分泌物中蛋白質(zhì)均抑制游動孢子成囊，且接種前后無明顯差異（見圖1B）。

2.3 大豆種子分泌物中蛋白質(zhì)對大豆疫霉游動孢子萌發(fā)的影響

大豆抗病品種Williams 82 接種前后種子分泌物中蛋白質(zhì)均抑制大豆疫霉游動孢子萌發(fā)，且接種前后萌發(fā)促進指數(shù)在處理8 和9 h 時差異顯著。大豆感病品種Sloan 接種前后種子分泌物中蛋白質(zhì)對游動孢子萌發(fā)的影響不同，接種前促進而接種后抑制游動孢子萌發(fā)，且抑制強度顯著高于抗病品種Williams 82。接種前感病品種Sloan 種子分泌物中蛋白質(zhì)對游動孢子萌發(fā)的促進作用在處理10 h時驟然減弱，其萌發(fā)促進指數(shù)趨近于0（見圖1C）。

2.4 大豆種子分泌中蛋白質(zhì)種類數(shù)量

經(jīng)LC-MS/MS鑒定，大豆抗病品種Williams 82接種后種子分泌物中蛋白質(zhì)種類較接種前有所減少；大豆感病品種Sloan 接種后種子分泌物中蛋白質(zhì)種類較接種前增加26種。大豆感病品種Sloan接種前種子分泌物中蛋白質(zhì)種類多于抗病品種（見圖2A、B、C）。

2.5 大豆抗、感品種接種前種子分泌物中差異蛋白

LC-MS/MS 鑒定結(jié)果表明，與抗病品種Williams 82相比，大豆感病品種Sloan接種前種子分泌物中存在191種差異蛋白，其中68個蛋白質(zhì)有注釋功能。根據(jù)蛋白質(zhì)功能分為14類：催化活性（14種）；水解酶活性（7種）；抗氧化活性（2 種）；新陳代謝（9 種）；氧化還原活性（1 種）；貯藏蛋白（1種）；細胞分裂及分化（4種）；酶調(diào)節(jié)活性（13種）；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（2 種）；轉(zhuǎn)錄因子（1 種）；啟動因子（2種）；轉(zhuǎn)運蛋白（3種）；抗逆性（6種）；防御活性（3種）。其中紫色酸性磷酸酶具有多種功能，影響植物抗逆境、抗衰老、細胞發(fā)育和代謝等過程[12]；大豆基因組中發(fā)現(xiàn)編碼NDPKⅠ的片段，其參與植物生長發(fā)育、感病應(yīng)激、非生物脅迫和激素響應(yīng)[13]。此外，鑒定出3 種與植物防御活性相關(guān)的蛋白質(zhì)：類葡聚糖β-1,3-葡萄糖苷內(nèi)切酶5、類β-葡糖苷酶18和多聚半乳糖醛酸酶抑制劑蛋白（見表1）。

表1 大豆感病品種Sloan接種前種子分泌物中蛋白質(zhì)與抗病品種Williams 82差異蛋白(抗逆蛋白和防御蛋白）Table 1 Differential proteins in the seed exudates of soybean susceptible cultivar Sloan compared with resistance cultivar Williams 82 before inoculation with Phytophthora sojae(Abiotic stress proteins and defense proteins)

與大豆感病品種Sloan 相比，大豆抗病品種Williams 82接種前種子分泌物中共鑒定出144種差異蛋白，其中46 種功能已知。根據(jù)蛋白質(zhì)功能分為10類：催化活性（3種）；水解酶活性（8種）；抗逆性（8種）；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（1種）；新陳代謝（4種）；轉(zhuǎn)運蛋白（1 種）；防御活性（14 種）；酶調(diào)節(jié)活性（2種）；貯藏蛋白（3 種）；AAI_LTSS 蛋白質(zhì)（2 種）。14種具有防御活性的蛋白質(zhì)包括：鏈A，1種皮過氧化物酶、類葡聚糖β-1,3-葡萄糖苷內(nèi)切酶8、類葡聚糖β-1, 3-葡萄糖苷內(nèi)切酶3、類kiwellin 蛋白、半胱氨酸蛋白酶、Bowman-Birk型蛋白酶抑制劑、類vicilin抗菌肽2、類葡聚糖β-1,3-葡萄糖苷內(nèi)切酶1、類葡聚糖β-1,3-葡萄糖苷內(nèi)切酶3異構(gòu)體、類過氧化物酶20、類過氧化物酶10、GDSL酯酶/脂肪酶、脂氧合酶1。大豆抗病品種Williams 82差異蛋白中具有防御活性的蛋白質(zhì)種類多于感病品種（見表2）。

2.6 大豆抗病品種Williams 82接種前后種子分泌物中差異蛋白

經(jīng)LC-MS/MS鑒定，與接種前相比，大豆抗病品種Williams 82接種后種子分泌物中存在141種差異蛋白，其中42個功能已知。根據(jù)功能分為10類：水解酶活性（4 種）；轉(zhuǎn)錄因子（4 種）；轉(zhuǎn)運蛋白（1種）；抗逆性（3種）；新陳代謝（7種）；氧化還原活性（3種）；防御活性（9種）；RNase活性（1種）；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（4種）；酶調(diào)節(jié)活性（6種）?？鼓嫘缘鞍爪?谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽還原酶均與植物適應(yīng)非生物脅迫有關(guān)[15]。鑒定出9種與植物防御有關(guān)的蛋白質(zhì)，包括超氧化物歧化酶、類非洲奇異果蛋白、類TMV 抗性蛋白N、類枯草桿菌蛋白酶、環(huán)核苷酸門控離子通道、酸性幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖內(nèi)切酶、PR-4、胚胎發(fā)育后期豐富蛋白（見表3）。

2.7 大豆感病品種Sloan接種前后種子分泌物中差異蛋白

LC-MS/MS 質(zhì)譜鑒定大豆感病品種Sloan 接種后種子分泌物中蛋白質(zhì)與接種前存在173種差異蛋白，經(jīng)查證其中59 種蛋白質(zhì)有文獻表明其功能。根據(jù)蛋白質(zhì)功能分為15類：水解酶活性（6種）；貯藏蛋白（4 種）；新陳代謝（10 種）；轉(zhuǎn)酰基作用（2種）；轉(zhuǎn)運蛋白（1種）；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（5種）；酶調(diào)節(jié)活性（2 種）；細胞器RNA 調(diào)控（4 種）；氧化還原活性（1種）；轉(zhuǎn)錄因子（2種）；抗逆性（7種）；啟動因子（1種）；防御活性（8種）；抗氧化活性（1種）；催化活性（5 種）。大豆疫霉接種后誘導(dǎo)出8 種具有防御活性的差異蛋白，包括kiwellin 蛋白、類葡聚糖β-1,3-葡萄內(nèi)切糖苷酶、類α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑、β-1,3-葡聚糖酶、類枯草桿菌蛋白酶、類PR-5、類UDP-半乳糖/UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)運體、外囊復(fù)合體組分。此外，磷脂酶dα1影響鹽脅迫和脫落酸耐受性[16]；半胱氨酸蛋白酶抑制劑參與植物對逆境脅迫的應(yīng)答、衰老、細胞程序化死亡等生理過程[17]（見表4）。

表2 大豆抗病品種Williams 82接種前種子分泌物中蛋白質(zhì)與感病品種Sloan差異蛋白（抗逆蛋白和防御蛋白）Table 2 Differential proteins in the seed exudates of soybean resistance cultivar Williams 82 compared with susceptible cultivar Sloan before inoculation with Phytophthora sojae(Abiotic stress proteins and defense proteins)

表3 大豆抗病品種Williams 82接種前后種子分泌物中差異蛋白（抗逆蛋白和防御蛋白）Table 3 Differential proteins in the seed exudates of soybean resistance cultivar Williams 82 after inoculation compared with pre-inoculation with Phytophthora sojae(Abiotic stress proteins and defense proteins)

續(xù)表

表4 大豆感病品種Sloan接種前后種子分泌物中差異蛋白（抗逆蛋白和防御蛋白）Table 4 Differential protein in the seed exudates of soybean susceptible cultivar Sloan after inoculation compared with pre-inoculation with Phytophthora sojae(Abiotic stress proteins and defense proteins)

3 討論與結(jié)論

目前，對于植物防御機制，國內(nèi)外學(xué)者研究較深入。但對種子在微生物密集土壤中發(fā)芽和生存的機制了解有限。大豆抗、感品種種子分泌物均有效吸引大豆疫霉游動孢子，而抗病品種Williams 82種子分泌物顯著抑制大豆疫霉卵孢子形成及萌發(fā)和孢囊萌發(fā)[8]，說明大豆種子分泌物中存在防御大豆疫霉的物質(zhì)。為了解大豆種子分泌物在植物防御中的作用，本試驗重點研究大豆種子分泌物中蛋白質(zhì)特性及其對大豆疫霉游動孢子的影響。

種子分泌物中蛋白質(zhì)對真菌生長的體外抑制作用已被證實[18]。大豆抗、感品種種子分泌物中蛋白質(zhì)對大豆疫霉游動孢子的趨化性影響存在差異。感病品種Sloan 接種前種子分泌物中蛋白質(zhì)吸引大豆疫霉游動孢子，接種后排斥游動孢子；接種前后均促進游動孢子成囊，接種前促進孢囊萌發(fā)，接種后抑制孢囊萌發(fā)，說明感病品種Sloan 種子分泌物中存在對游動孢子有趨化作用的蛋白質(zhì)，接種后誘導(dǎo)防御活性更強的蛋白質(zhì)?？共∑贩NWilliams 82 接種前后種子分泌物中蛋白質(zhì)均排斥游動孢子，接種后排斥作用更強，均抑制游動孢子成囊和孢囊萌發(fā)，說明接種后可能誘導(dǎo)種類更多、含量更高、活性更強的與植物防御有關(guān)的蛋白質(zhì)。

感病品種Sloan 接種后誘導(dǎo)8 種已知具有植物防御活性的差異蛋白。其中kiwellin 蛋白可抵抗真菌誘導(dǎo)的宿主代謝干擾，阻斷真菌效應(yīng)酶的酶活性[19]；PR-5 主要參與防御病原物感染的植物防御系統(tǒng)，如抑制真菌孢子萌發(fā)或菌絲生長。因此，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)可能通過排斥游動孢子和抑制孢囊萌發(fā)參與大豆種子對大豆疫霉的防御機制。

抗病品種Williams 82接種后誘導(dǎo)出9種已知與植物防御相關(guān)的差異蛋白。其中PR-4通過直接抑制內(nèi)切殼多糖酶和水解酶保護宿主，致使幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和過氧化物酶表達；類枯草桿菌蛋白酶誘導(dǎo)植物和病原物互作過程中的PCD 和HR，具有病原物抗性和免疫激發(fā)作用，說明這些差異蛋白可能在抗病品種Williams 82 防御大豆疫霉的過程中發(fā)揮重要作用。

大豆抗、感品種接種前種子分泌物中共鑒定出17 種具有植物防御活性的差異蛋白，抗病品種多于感病品種。大豆種子中胰蛋白抑制劑抑制植物病原微生物各種酶[20]?？共∑贩NWilliams 82中存在Bowman-Birk型蛋白酶抑制劑，可能參與大豆對大豆疫霉的防御過程。此外，過氧化物酶、脂氧合酶均與植物對病原物反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，大豆種子對蛋白質(zhì)的選擇性分泌可能有助于對大豆疫霉的防御機制，且接種后誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)防御活性更強，因此認為大豆分泌蛋白在植物對土壤病原物的防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用。后續(xù)應(yīng)研究具體的防御蛋白，了解其對大豆疫霉的生理活性，為大豆抗病機制和抗病育種研究提供理論依據(jù)。