陳中堅(jiān)+馬小涵+董林林+張連娟+尉廣飛+肖麗娜+王勇+魏福剛+劉偉林+余育啟+陳士林

[摘要] 藥用植物DNA標(biāo)記輔助育種加快新品種選育及推廣的進(jìn)程，保障中藥材產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。該研究以首個(gè)三七DNA標(biāo)記輔助選育新品種—“苗鄉(xiāng)抗七1號(hào)”為研究對(duì)象，系統(tǒng)評(píng)價(jià)其種子、種苗、塊根對(duì)根腐病致病菌Fusarum oxysporum的抗性。結(jié)果表明，與常規(guī)栽培種相比，接種7 d，抗病品種種子病情指數(shù)下降52.0%；接種25 d，抗病品種種苗死苗率及塊根病情指數(shù)分別下降72.1%，62.4%；此外，接種后抗病品種種子及種苗生長(zhǎng)抑制率下降?！懊玎l(xiāng)抗七1號(hào)”種子、種苗、塊根對(duì)根腐病表現(xiàn)顯著的抗性，該品種的抗性評(píng)價(jià)將為新品種的推廣提供依據(jù)，保障三七無(wú)公害栽培的順利開(kāi)展。

[關(guān)鍵詞] 三七；根腐??；抗病品種；發(fā)病率；病情指數(shù)

[Abstract] DNA marked-assisted selection of medicinal plants accelerated the breeding and promotion of new cultivars，and guaranteed the healthy development of Chinese medicinal materials industry. The first disease-resistant cultivar of notoginseng，namely "Miaoxiang Kangqi 1"，served as the object of study. We evaluated the Kangqi′s resistance of seeds，seedlings and root against the pathological bacteria （Fusarum oxysporum） of root rot. Compared to the traditional cultivars，the disease index of notoginseng seeds declined by 52.0% after inoculation for seven days；the death rate of seedlings and disease index of root respectively decreased by 72.1% and 62.4% after inoculation for 25 days. Additionally，the growth inhibition ratio of notoginseng seeds and seedlings declined after inoculation. The seeds，seedlings and roots of “Miaoxiang Kangqi 1” showed significantly resistant to root rot. The evaluation of disease-resistance of Kangqi provided the basis for the popularization of new cultivar and guaranteed the favoring conduct of notoginseng pollution-free cultivation.

[Key words] Panax notoginseng；root rot；disease-resistant cultivars；incidence rate；disease index

DNA 標(biāo)記輔助藥用植物新品種的選育，該方法不僅準(zhǔn)確性高而且縮短育種周期。研究團(tuán)隊(duì)利用DNA標(biāo)記輔助育種結(jié)合系統(tǒng)選育的方法，培育了首個(gè)三七抗病新品種—苗鄉(xiāng)抗七1號(hào)（云林園植新登第2016060號(hào)）；該研究基于簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)出抗病群體的特異SNP位點(diǎn)，利用與三七抗根腐病相關(guān)的SNP位點(diǎn)篩選抗病群體進(jìn)而輔助系統(tǒng)選育，該方法提高選育效率并縮短了選育周期[1]。此外，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)全基因組測(cè)序篩選出30個(gè)非同變異突變SNP標(biāo)記作為中研肥蘇1號(hào)（京品鑒藥2016054）特異性SNP標(biāo)記用于紫蘇新品種的材料鑒選[2]。DNA標(biāo)記輔助育種技術(shù)應(yīng)用于重要農(nóng)藝性狀的定位，有效篩選出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆的藥用植物新品種。

根腐病是三七的主要病害類(lèi)型，該病害造成損失可達(dá)70%以上，甚至導(dǎo)致毀園絕收[3]。研究表明，隨著三七種植年限的增加，根腐病致病菌Fusarum oxysporum豐度顯著增加，三七死苗率逐年升高[4]。根腐病害的有效防治是保障三七產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的前提。當(dāng)前化學(xué)防治是三七根腐病的主要防治方法，種植生產(chǎn)中使用的農(nóng)藥（殺菌劑）成份近70種以上[5]。種植環(huán)節(jié)頻繁使用農(nóng)藥導(dǎo)致藥材農(nóng)藥及重金屬等有害物質(zhì)污染嚴(yán)重，而性狀優(yōu)良、抗逆性強(qiáng)三七新品種的大面積推廣將減少農(nóng)藥的使用量，降低農(nóng)殘對(duì)環(huán)境及人體健康的危害，促進(jìn)并保障三七無(wú)公害栽培的推廣。本文通過(guò)對(duì)“苗鄉(xiāng)抗七1號(hào)”的種子、種苗、塊根進(jìn)行系統(tǒng)的抗性評(píng)價(jià)，進(jìn)而保障三七抗病品種大面積推廣的順利開(kāi)展。

1 材料與方法

1.1 三七種子催芽處理 將“苗鄉(xiāng)抗七1號(hào)”及三七普通栽培種的種子進(jìn)行沙培催芽處理用于后續(xù)試驗(yàn)。選取飽滿的三七種子進(jìn)行脫皮處理，脫皮后的種子采用10% H₂O₂消毒10 min，與滅菌處理的細(xì)沙混勻（2∶1，含水量80%），放置22 ℃恒溫培養(yǎng)箱，每天補(bǔ)充滅菌水以保證其含水量。

1.2 三七種子的抗性評(píng)價(jià) 挑選露白后大小一致的三七種子進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。將滅菌后的雙層濾紙放置在9 cm玻璃培養(yǎng)皿中，10% H₂O₂消毒5 min后的種子經(jīng)滅菌水清洗3～5次并放置在濾紙上，加入4 mL滅菌水后放至25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。每皿中放置10粒三七種子，5次重復(fù)。7 d后，用滅菌針將三七胚根部位劃傷，進(jìn)行接種試驗(yàn)。接種菌株為根腐病的致病菌尖孢鐮刀菌Fusarum oxysporum，該菌株分離于三七根腐病塊根中并具有較高的致病性[4]。處理組為：普通栽培種及抗病品種種子分別接種1 mL F. oxysporum菌液 （1×10⁶cfu·mL^-1）至培養(yǎng)皿中；對(duì)照組為：普通栽培種及抗病品種種子分別接種1 mL滅菌后的菌液。接種后，每24 h記錄發(fā)病情況并統(tǒng)計(jì)發(fā)病率及發(fā)病指數(shù)；7 d之后，統(tǒng)計(jì)三七種子的根長(zhǎng)，評(píng)價(jià)普通栽培種及抗病品種種子對(duì)根腐病的抗病性。

1.3 三七種苗的抗性評(píng)價(jià) 將催芽后的三七種子播種于滅菌后的營(yíng)養(yǎng)土中，接種病原菌評(píng)價(jià)三七種苗的抗病性。選取大小一致的種子播種育種穴盤(pán)，待種苗生長(zhǎng)30 d之后，進(jìn)行接種試驗(yàn)。處理組為：普通三七及抗病品種的種苗根際接種500 μL 的F. oxysporum菌液（1×10⁶cfu·mL^-1）；對(duì)照組為：普通三七及抗病品種種苗根際接種滅菌后菌液（500 μL），接種后每5 d統(tǒng)計(jì)三七死苗率，25 d之后，記錄三七種苗的株高，葉面積及鮮重，分析普通栽培種及抗病品種的生長(zhǎng)指標(biāo)。其中，葉面積=中葉長(zhǎng)×中葉寬，每種處理50株，3次重復(fù)。

1.4 三七塊根的抗性評(píng)價(jià) 通過(guò)盆栽接種試驗(yàn)，評(píng)價(jià)三七塊根的抗病性。參照王瑞等[6]方法稍作調(diào)整，將健壯的兩年生普通三七栽培種及抗病品種塊根切傷，處理組三七塊根浸泡于F. oxysporum孢子懸浮液（1×10⁶cfu·mL^-1），對(duì)照組塊根浸泡于滅活的菌液，過(guò)夜處理后將三七塊根栽種于滅菌后的營(yíng)養(yǎng)土中，每5 d隨機(jī)取10株記錄塊根的發(fā)病率及病情指數(shù)。每組處理50株，3次重復(fù)。

1.5 病害分析 三七根腐病發(fā)病率=（染病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%。三七死苗率=（死苗株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%。三七病情指數(shù)=[（各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)級(jí)數(shù)）/調(diào)查總株樹(shù)×最高級(jí)別值] ×100%，三七病情根據(jù)Vakalounakis 等[7]報(bào)道進(jìn)行分級(jí)，分為0級(jí)，1級(jí)，2級(jí)，3級(jí)，0級(jí)=根部無(wú)發(fā)病癥狀；1級(jí)=根部輕微或中度變褐；3級(jí)=根部嚴(yán)重變褐；4級(jí)=根部腐爛或死苗。

1.6 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 16.0軟件，在0.05水平進(jìn)行顯著性方差分析。

2 結(jié)果

2.1 三七種子抗性評(píng)價(jià) 苗鄉(xiāng)抗七1號(hào)的種子對(duì)根腐病致病菌F. oxysporum表現(xiàn)顯著抗性（圖1）。傷根接種致病菌F. oxysporum 1 d，普通栽培種發(fā)病率為85.0%，接種2 d發(fā)病率達(dá)100%；而接種1 d抗病品種發(fā)病率為55.0%，接種2 d發(fā)病率達(dá)85%，接種4 d發(fā)病率達(dá)100%，接種滅活菌液的三七種子未出現(xiàn)根腐病的病害癥狀（圖1a）。結(jié)果表明，與普通栽培種相比，抗病品種延緩根腐病發(fā)病時(shí)間。隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，三七種子根腐病的病情指數(shù)增加，接種1～7 d，普通栽培種根腐病的病情指數(shù)為31.7%～83.3%，抗病品種根腐病的病情指數(shù)為18.3%～40.0%，與普通栽培種相比，抗病品種病情指數(shù)下降42.3%～52.0%（圖1b）。

根腐病致病菌導(dǎo)致三七根尖變褐，須根及主根生長(zhǎng)受到抑制（圖2a），接種失活菌液的普通栽培種及抗病品種根長(zhǎng)分別為2.50，2.30 cm，接種活性致病菌的普通栽培種及抗病品種根長(zhǎng)分別為1.51 cm，1.72 cm（圖 2b）；與對(duì)照組相比，普通栽培種及抗病品種相比，其根長(zhǎng)分別下降39.8%，25.4%。結(jié)果表明，與普通栽培種相比，接種后抗病品種種子生長(zhǎng)抑制率下降。

2.2 三七種苗抗性評(píng)價(jià) 苗鄉(xiāng)抗七1號(hào)種苗對(duì)根腐病致病菌F. oxysporum表現(xiàn)顯著抗性（圖3）。接種致病菌的三七種苗根部變褐，嚴(yán)重者根部腐爛，地上部倒伏枯萎，接種滅活菌液的三七種苗均為出現(xiàn)根腐病癥狀（圖3a）。接種10 d以內(nèi)，普通栽培種死苗率為5.0%～15.2%，而抗病品種未出現(xiàn)死苗現(xiàn)象；接種10～25 d以內(nèi)，普通栽培種死苗率35.0%～65.0%，而抗病品種死苗率為10.0%～26.7%；與普通栽培種相比，抗病品種死苗率下降58.9%～72.1%（圖3b）。未接菌的普通栽培種及抗病品種均未出現(xiàn)根腐病癥狀。

接種25 d之后，與普通栽培種相比，抗病品種種苗生長(zhǎng)抑制率下降（圖4）。未接種活性菌的普通栽培種（對(duì)照組）株高、葉面積、鮮重分別為6.39 cm，3.62 cm2，0.46 g/株；接種活性菌的普通栽培種（處理組）株高、葉面積和鮮重分別為5.98 cm，3.01 cm-2，0.36 g/株。未接種活性菌的抗病品種（對(duì)照組）株高、葉面積和鮮重分別為5.77 cm，2.86 cm2，0.40 g/株；接種活性菌的抗病品種（處理組）株高、葉面積和鮮重分別為5.52 cm，2.52 cm2，0.35 g/株。與對(duì)照組相比，普通栽培種株高、葉面積和鮮重分別下降6.4%，16.9%，21.7%；抗病品種株高、葉面積和鮮重分別下降4.3%，11.9%，12.5%。

2.3 三七塊根抗病性評(píng)價(jià) “苗鄉(xiāng)抗七1號(hào)”的兩年生幼苗對(duì)根腐病致病菌F. oxysporum表現(xiàn)顯著抗性（圖5）。根腐病致病菌導(dǎo)致三七須根脫落，根部變褐色甚至腐爛，接種滅活菌的三七塊根未出現(xiàn)根腐病癥狀（圖5a，b）。接種活性菌15天以內(nèi)，抗病品種根腐病的發(fā)病率為12.0%～62.7%，而普通栽培種根腐病發(fā)病率為26.0%～100%，與普通栽培種相比，抗病品種根腐病發(fā)病率顯著下降37.3%～53.8%（圖5c）。隨著接種活性菌時(shí)間的增加，三七塊根的病情指數(shù)增加，抗病品種根腐病病情指數(shù)為6.3%～38.3%，普通栽培種的病情指數(shù)為16.8%～65.0%，與普通栽培種相比，抗病品種根腐病的病情指數(shù)顯著下降35.8%～62.4%（圖5d）。

3 討論

本研究對(duì)首個(gè)DNA標(biāo)記輔助培育的三七新品種——“苗鄉(xiāng)抗七1號(hào)”的抗病性進(jìn)行系統(tǒng)性評(píng)價(jià)，該品種種子、種苗及塊根對(duì)根腐病致病菌F. oxysporum表現(xiàn)顯著抗性。與普通栽培種相比，接種活性菌7 d抗病品種種子病情指數(shù)下降52.0%；接種25 d，抗病品種種苗死苗率下降72.1%，抗病品種塊根病情指數(shù)下降62.4%。三七無(wú)公害栽培的目的為栽培出健康無(wú)害的三七植物，同時(shí)滿足自然環(huán)境正常有序發(fā)展要求的栽培模式，進(jìn)而達(dá)到無(wú)公害品質(zhì)。前期工作中，規(guī)定25項(xiàng)農(nóng)藥種類(lèi)、4項(xiàng)重金屬的限量指標(biāo)作為無(wú)公害品質(zhì)三七藥材及飲片的判定依據(jù)[5]。因此，“苗鄉(xiāng)抗七1號(hào)”對(duì)根腐病表現(xiàn)顯著的抗性，將為三七無(wú)公害栽培的推廣提供基礎(chǔ)。

與普通栽培種相比，接種試驗(yàn)中“苗鄉(xiāng)抗七1號(hào)”種子及種苗生長(zhǎng)抑制率下降，種子及塊根發(fā)病時(shí)間延緩。三七單株根重、株高等農(nóng)藝性狀與種苗質(zhì)量相關(guān)，而三七產(chǎn)量與種苗等級(jí)呈正相關(guān)[8]?！懊玎l(xiāng)抗七1號(hào)”種子種苗的抗病性是實(shí)現(xiàn)三七產(chǎn)量的保障。根腐病是藥用植物生產(chǎn)中的一種毀滅性病害，該病發(fā)生后，容易傳染、發(fā)病率高、防治困難，具有“植物癌癥”之稱(chēng)，一般藥用植物根腐病的發(fā)病率為10%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)70%～80%，有時(shí)甚至100%，導(dǎo)致中藥材絕產(chǎn)絕收[9]。三七根腐病的病原菌具有多樣性，但以真菌為主，F(xiàn).solani，F(xiàn). oxysporum，F(xiàn). monilliforme均能造成三七根腐病的發(fā)生[10-12]。研究團(tuán)隊(duì)前期工作中，分離到三七根腐病的高毒致病菌F. oxysporum[4]。本文以F. oxysporum作為抗病品種病原菌進(jìn)行檢驗(yàn)，其結(jié)果具有代表性。

三七抗病新品種的推廣將促進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。三七是血塞通、云南白藥、片仔癀等藥品的主要原料，每年三七的社會(huì)需求量為 1.5萬(wàn)t左右，截止至 2015 年，云南省三七藥材及其飲片制品的市場(chǎng)規(guī)模已經(jīng)達(dá)到每年 150億元人民幣的產(chǎn)值[5]。為滿足日益增長(zhǎng)的需求，三七人工栽培已形成較為成熟的技術(shù)體系，然而三七為典型的生態(tài)脆弱性植物，其分布區(qū)域較窄，存在連作障礙嚴(yán)重等問(wèn)題[13-15]。三七栽培過(guò)程中，頻繁使用農(nóng)藥，導(dǎo)致藥材中農(nóng)藥和重金屬污染現(xiàn)象嚴(yán)重，中藥材質(zhì)量每況愈下，危害人類(lèi)健康及環(huán)境安全。為保證三七藥材質(zhì)量，保護(hù)人類(lèi)健康及生態(tài)環(huán)境安全，陳士林等[16]提出發(fā)展無(wú)公害中藥材生產(chǎn)，建立標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化技術(shù)體系，已成為中藥材生產(chǎn)發(fā)展和促進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的必然方向和迫切需要；并指出從生產(chǎn)基地選址、基地環(huán)境、野生撫育等栽培管理技術(shù)、采收、產(chǎn)地加工技術(shù)、病蟲(chóng)害綜合防治及質(zhì)量控制技術(shù)等方面實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，確保生產(chǎn)無(wú)污染、高品質(zhì)、安全的中藥材，保證消費(fèi)者生命安全和身體健康。此外，研究團(tuán)隊(duì)也指出土壤改良、新品種選育、安全和低毒的病蟲(chóng)害防治是三七無(wú)公害栽培的主要環(huán)節(jié)[17]。苗鄉(xiāng)抗七1號(hào)的推廣將有效的克服三七物種存在的主要障礙并將促進(jìn)綠色中藥農(nóng)業(yè)的科學(xué)化和規(guī)?；l(fā)展。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]