尹艷+劉遜+王兵+高琳惠+張夏楠

[摘要] 對中藥穿山甲及其混偽品進(jìn)行分子鑒定研究，建立一個穩(wěn)定、準(zhǔn)確的位點(diǎn)特異性PCR鑒別體系。收集整理穿山甲屬動物組織樣本及NCBI序列，提取基因組總DNA，PCR擴(kuò)增Cytb和COⅠ序列并測序，通過BioEdit軟件進(jìn)行序列比對，應(yīng)用MEGA 6.0構(gòu)建序列系統(tǒng)聚類樹，并根據(jù)序列特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)和篩選中華穿山甲特異性鑒別引物，并對PCR反應(yīng)條件進(jìn)行退火溫度、DNA模板上樣量和PCR循環(huán)數(shù)等條件的適應(yīng)性考查。結(jié)果表明：Cytb和COⅠ序列均能有效對穿山甲正、偽品進(jìn)行聚類分析；在位點(diǎn)特異性PCR反應(yīng)體系中，當(dāng)退火溫度為55～60 ℃，DNA模板量3～100 ng，PCR擴(kuò)增35個循環(huán)時，基于COⅠ序列的引物COⅠ-S10/A5 能使中華穿山甲擴(kuò)增出約400 bp的特異性條帶，而其他穿山甲品種擴(kuò)增結(jié)果為陰性。該文基于COⅠ序列的引物COⅠ-S10/A5能實(shí)現(xiàn)中華穿山甲與偽品印度穿山甲、馬來穿山甲、樹穿山甲等的準(zhǔn)確、穩(wěn)定鑒別。

[關(guān)鍵詞] 穿山甲；COⅠ；Cytb；分子鑒定

[Abstract] The study was aimed to establish a stable，accurate site specific PCR identification system to identify Manis pentadactyla and its adulterants using DNA molecular identification. The genomic DNA was extracted from experimental samples using the DNA extraction kit. The Cytb and CO Ⅰ genes were amplified using PCR and sequenced bi-directionally. Obtained sequences were assembled using the BioEdit software. The neighbor-joining tree was constructed by MEGA 6.0. Specific identification primers were designed according to the specific allelets，and PCR reaction system was optimized. The results indicated that the Cytb and CO Ⅰ sequence both were able to be used to identify M. pentadactyla and its adulterants. With the specific primers CO Ⅰ-S10/A5，the M. pentadactyla could be amplified a 400 bp DNA band when the annealing temperature ranged from 55 to 60 ℃ and the amount of DNA template ranged from 3 to 100 ng within 35 PCR cycles. However，other adulterants displayed no relevant bands. So that primers CO Ⅰ- S10 / A5 can be used to identify the M. pentadactyla with the adulterants.

[Key words] Manis pentadactyla；COⅠ；Cytb；molecular identification

穿山甲為鯪鯉科Manidae穿山甲屬M(fèi)ains動物，全球現(xiàn)存包括分布亞洲的中華穿山甲M. pentadactyla、印度穿山甲M. crassicaudata、馬來穿山甲M. javanica、菲律賓穿山甲M.culionensis 4種，分布非洲的樹穿山甲M. tricuspis、大穿山甲M. gigantea南非穿山甲M.temminckii和長尾穿山甲 M. tetradactyla 4種[1]。其中中華穿山甲是我國藥典規(guī)定的中藥穿山甲的唯一正品來源，是我國傳統(tǒng)名貴中藥之一[3-6]，具有活血消癥、通經(jīng)下乳、消腫排膿、搜風(fēng)通絡(luò)之功效，用于經(jīng)閉癥瘕、乳汁不通、癰腫瘡毒、風(fēng)濕痹痛、中風(fēng)癱瘓、麻木拘攣等癥。然而近年來中華穿山甲的資源極度稀缺，早在2013年世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN） 物種生存委員會（SSC） 穿山甲專家組（PSG） 會議中，中華穿山甲和馬來穿山甲在受脅物種紅色名錄（Redlist） 中的等級就被上調(diào)為極度瀕危級（Cr），而其他6 種穿山甲的等級也全部提升為瀕危級（En） [2]。穿山甲除藥用之外，其肉可食且被認(rèn)為味道鮮美兼具較高營養(yǎng)價值。穿山甲人工繁殖困難[7]，藥材等來源依靠野生資源捕獵且缺乏科學(xué)可持續(xù)手段?；谝陨显颍┥郊滓吧Y源逐漸匱乏[8]，穿山甲市場售價昂貴[9]，是以導(dǎo)致穿山甲非法捕獵和走私貿(mào)易泛濫[10-11]。

Gaudin T J等基于計(jì)算機(jī)技術(shù)對現(xiàn)存的7種和已經(jīng)滅絕的5種穿山甲的骨骼特征進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，從形態(tài)學(xué)上解釋了穿山甲生物地理學(xué)分布特征和物種進(jìn)化史[12]。劉遜等對穿山甲商品狀況及基源進(jìn)行了調(diào)查和鑒定，并總結(jié)了系列穿山甲鱗甲的基源鑒別依據(jù)[13]，但穿山甲鱗甲大小、顏色、紋理等隨源動物年齡、生活生態(tài)環(huán)境、鱗片部位等有所差異[14]，種內(nèi)變化大，種間辨識度低，非經(jīng)驗(yàn)豐富專家不能正確鑒別。與之相比，DNA分子技術(shù)具有不受樣品形態(tài)、數(shù)量等限制的優(yōu)點(diǎn)，對于穿山甲這一類珍稀物種的種源鑒定具有獨(dú)特的優(yōu)勢，Tobe S S等也曾提出用DNA特異性片段作為珍貴瀕危物種的鑒定新方法[15]。目前關(guān)于穿山甲分子鑒定方面的研究較少，尤其缺乏穿山甲屬內(nèi)種間分子鑒別的研究。本文應(yīng)用分子標(biāo)記方法對穿山甲屬不同種動物進(jìn)行鑒別，并基于標(biāo)記序列建立一個位點(diǎn)特異性PCR體系，以準(zhǔn)確快速區(qū)分中華穿山甲與其他穿山甲品種。

1 材料

1.1 樣品

共收集穿山甲樣品供24份（表1），其中鱗甲19份，筋膜5份。由首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心和江蘇衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院劉遜副教授鑒定保存并饋贈。

1.2 儀器

PCR儀（Applied Biosystems Veriti）；微量核酸定量儀（NanoDrop 2000C）；高級熒光化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（FUSION-SL）。

1.3 試劑

Wizard SV Genomic DNA Purification System （Promega，0000178703）；2×EasyTaq PCR SuperMix （TRANS，AS111）；2×KAPA HiFi Hotstart ReadyMix（KAPA，00061748）；2K DNA Marker（TRANS，E110）；Gene Green Nucleic Acid Dye（TIANGEN，P4829）。

2 方法

2.1 基因組DNA的提取、通用引物PCR擴(kuò)增及測序

選用了Promega Wizard SV Genomic DNA Purification System進(jìn)行穿山甲鱗甲和筋膜的DNA提取，按照試劑盒的說明，樣品粉碎后取30～50 mg 加入275 μL消化液55 ℃消化處理過夜（16～18 h），隨后進(jìn)行裂解，釋放基因組DNA，并利用吸附柱吸附，經(jīng)漂洗液去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)后，用雙蒸水500 μL分2次洗脫獲得基因組DNA。各樣品分別用通用引物（表2）以高保真酶擴(kuò)增COⅠ和Cytb序列并進(jìn)行測序。PCR擴(kuò)增體系為2×KAPA HiFi Hotstart ReadyMix 25 μL，正反向引物各1.5 μL，DNA 5 μL，無菌水補(bǔ)足至50 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳后對目的片段切膠回收，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序部測序，各樣品均采用正反雙向測序，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2 序列分析

將測序結(jié)果使用MEGA 6.0進(jìn)行比對并建立構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹（鄰接法），Bootstrap（1 000次重復(fù)）檢驗(yàn)各分支的支持率。

2.3 特異性鑒別引物的設(shè)計(jì)

將所測得的序列與GenBank中下載的穿山甲序列用BioEdit軟件進(jìn)行多重比對分析，找出具有穩(wěn)定差異的特異性片段，篩選獲得變異位點(diǎn)，通過該位點(diǎn)運(yùn)用Premier Primer 5.0軟件針對中華穿山甲的特異性片段設(shè)計(jì)鑒別引物，并由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

2.4 特異性鑒別引物篩選

取穿山甲不同樣品DNA進(jìn)行位點(diǎn)特異性PCR，所用20 μL反應(yīng)體系為：2×EasyTaq PCR Super Mix 10 μL，正反向引物各0.4 μL，DNA經(jīng)微量核酸定量儀定量并稀釋至10 mg·L^-1后取1 μL，無菌水補(bǔ)齊。PCR產(chǎn)物通過添加Gene Green 核酸染料染色的1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下顯色觀察。以結(jié)果出現(xiàn)特異擴(kuò)增片段為陽性，無擴(kuò)增為陰性，由此判斷引物特異性。

2.5 特異性PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

為優(yōu)化位點(diǎn)特異性PCR反應(yīng)條件，分別考察了DNA模板上樣量（3，5，10，30，50，100 ng）、退火溫度（55，57，60 ℃）、PCR循環(huán)數(shù)對特異性PCR結(jié)果的影響。

3 結(jié)果與分析

3.1 基于Cytb和COⅠ序列的系統(tǒng)聚類樹構(gòu)建結(jié)果

采用MEGA 6.0分析軟件進(jìn)穿山甲屬動物Cytb和COⅠ序列系統(tǒng)聚類樹的構(gòu)建（圖1，2）。亞洲產(chǎn)區(qū)與非洲產(chǎn)區(qū)的穿山甲分別聚為2支，亞洲產(chǎn)穿山甲中，中華產(chǎn)山甲、印度穿山甲與馬來產(chǎn)山甲又分別聚為一支，種間區(qū)分置信度≥99%，表明Cytb和COⅠ序列用于穿山甲的分子鑒定具有可行性。2種序列所建NJ樹中，樣品J8，J11，J12，J15，J16，R2均與NCBI上下載的中華穿山甲序列聚為一支，說明這6個樣品為正品中華穿山甲。而樣品R6，R3，J6為印度穿山甲，R5為樹穿山甲，其余樣品為馬來穿山甲。

3.2 特異性引物篩選結(jié)果

用基于Cytb和COⅠ序列設(shè)計(jì)的中華穿山甲位點(diǎn)特異性引物以各穿山甲樣品DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選獲得一對特異性引物COⅠ-S10/A5。該對引物對中華穿山甲在一定條件下能擴(kuò)增出400 bp的特異片段，而印度穿山甲、馬來穿山甲和樹穿山甲擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；而COⅠ通用引物對所有DNA模板均能有效擴(kuò)增出750 bp明亮清晰的片段，證明引物COⅠ-S10/A5對中華穿山甲具有良好的特異性（圖3）。

3.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件優(yōu)化

3.3.1 DNA模板量的考查 對20 μL PCR 反應(yīng)體系中的模板DNA用量進(jìn)行了考察（圖4），DNA在3～100 ng時，中華穿山甲（1，2）能擴(kuò)增出特異性條帶，且隨模板量減少條帶變暗，模板量降至3 ng時條帶已經(jīng)難以辨識；偽品在DNA模板量3～100 ng擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，因此建議本方法中DNA模板用量以3～100 ng為宜。

3.3.2 退火溫度和PCR循環(huán)次數(shù)對結(jié)果的影響 如退火溫度在55～60 ℃，PCR擴(kuò)增35個循環(huán)時，中華穿山甲（1，2）能擴(kuò)增出特異性條帶（陽性），且偽品擴(kuò)增結(jié)果為陰性。當(dāng)PCR循環(huán)數(shù)減少至28個，正品特異性條帶明顯變?nèi)?，甚至無法辨識；循環(huán)數(shù)增加至?xí)r，偽品出現(xiàn)假陽性擴(kuò)增（圖5，6）。

4 結(jié)論與討論

2016年9月舉行的第17屆《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》締約方大會（CITESCoP17）擬通過了將亞洲和非洲的全部8種穿山甲由原來的《公約》附Ⅱ提升到附錄Ⅰ的提案，全面禁止穿山甲的國際貿(mào)易。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，野生穿山甲在亞洲地區(qū)已經(jīng)很難找到，對穿山甲藥用和食用需求，刺激了非洲穿山甲非法走私貿(mào)易網(wǎng)絡(luò)的形成[17]。Zhang H等收集了大量走私穿山甲樣本并應(yīng)用法醫(yī)學(xué)中DNA取證的方法對這些樣本的來源及可能的走私路徑進(jìn)行了分析，論證了DNA取證的方法在野生動物非法貿(mào)易檢測上的應(yīng)用價值[18]。作為中國傳統(tǒng)用藥的唯一正品來源，中華穿山甲的準(zhǔn)確便捷鑒別能一定程度上有效抑制外來穿山甲品種向中國的輸入，并有效打擊國內(nèi)中華穿山甲的非法捕獵。

本研究通過特異引物篩選和條件優(yōu)化，確定20 μL PCR反應(yīng)體系時，基于COⅠ序列設(shè)計(jì)的引物COⅠ-S10/A5在DNA模板加樣量3～100 ng，退火溫度55～60 ℃時，擴(kuò)增35個循環(huán)可將正品中華穿山甲與其他偽品進(jìn)行有效的鑒別。由于穿山甲樣品組織的特殊性，選用了Promega Wizard SV Genomic DNA Purification System進(jìn)行穿山甲鱗甲和筋膜的DNA提取。該方法操作簡單，無酚、氯仿等污染，提取的穿山甲DNA經(jīng)微量核酸定量儀檢測，其質(zhì)量濃度在5～100 mg·L^-1，可直接用于本文所篩選的特異性引物進(jìn)行鑒定。本研究采用該試劑盒進(jìn)行了炮制穿山甲片DNA的提取實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)取樣量20 mg左右時，DNA量為5～20 mg·L^-1，且蛋白和小分子污染較為嚴(yán)重，采用特異性引物進(jìn)行鑒別時重復(fù)性不高，因此對于炮制甲片的鑒別研究有待進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過程。

對于標(biāo)記片段，分別擴(kuò)增了線粒體基因片段COⅠ（cytochrome oxidaseⅠ）和Cytb（cytochrome b），其中COⅠ序列為目前研究者普遍推薦的動物DNA通用條形碼序列，對鳥類、魚類、節(jié)肢動物、哺乳動物等均具有很好的物種鑒別能力[19]。此外，線粒體DNA具有的分子結(jié)構(gòu)相對簡單，較核DNA容易檢測且不易降解的優(yōu)勢，適用于穿山甲鱗甲這類DNA提取困難的樣品檢測。

此外，本研究中還構(gòu)建了穿山甲基于Cytb和COⅠ序列的系統(tǒng)聚類（NJ）樹，成功將不同種穿山甲區(qū)分開來，證明Cytb和COⅠ序列均適用于穿山甲的分子鑒定。NJ樹圖顯示，亞洲產(chǎn)區(qū)和非洲產(chǎn)區(qū)的穿山甲分別聚為一支，其下不同種穿山甲又各自分支聚集。中華穿山甲在我國分布有3個亞種：指名亞種（M. p. pentadactyla）分布于臺灣；華南亞種（M. p. aurita）見于華南一帶 14 個省區(qū)；海南亞種（M. p. pusilla ）產(chǎn)于海南[1]。但三者具體鑒別信息少有文獻(xiàn)報(bào)道。本文中Cytb和COⅠ序列的NJ樹均顯示，在中華穿山甲分支內(nèi)部，樣品J11，J12，J15，J16與樣品J8，R2及NCBI上下載的中華穿山甲序列又分別聚為一支，說明這2個分支所在樣品可能為兩個不同的中華穿山甲亞種，為中華穿山甲分類保護(hù)與研究提供參考依據(jù)。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]