張苗苗+符卓韜+陳劍濤+成業(yè)+朱伯強+符林春+周紅燕

[摘要] 為了評價健脾補腎解毒法中藥對猴艾滋病的干預(yù)效果。該實驗選用8只同期SIV感染恒河猴，隨機分為2組：健脾補腎解毒法中藥組（以下簡稱中藥組）和抗病毒藥組，分別給予中藥及抗病毒治療8周，每4周采集外周血檢測。結(jié)果顯示，健脾補腎解毒法中藥雖然不能像HAART一樣明顯降低血漿病毒載量，但可以升高外周血CD4，該亞群主要為CD4純真細(xì)胞；使CD4和CD8功能細(xì)胞數(shù)量增加，增強對病原體的免疫應(yīng)答；在一定程度上延緩了脾虛的出現(xiàn)和進(jìn)展。表明該藥有較好的免疫調(diào)節(jié)作用，具有相當(dāng)?shù)呐R床價值和應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞] 艾滋病；中藥；免疫調(diào)節(jié)

[Abstract] To evaluate the effect of Chinese medicine of invigorating spleen and kidney detoxification on simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaque. Eight SIV rhesus macaques of the same age were randomly divided into Chinese medicine of invigorating spleen and kidney detoxification group（hereinafter referred to as Chinese medicine group） and anti-virus drug（HAART） group. The traditional Chinese medicine and antiviral therapy were given for 8 weeks，and peripheral blood was collected for detection in every 4 weeks. The results showed that Chinese medicine of invigorating spleen and kidney detoxification could not obviously decrease plasma viral load as HAART，but it can increase CD4 number in peripheral blood，especially the CD4 naive cells，and increase the number of CD4 and CD8 cells，enhance the immune response to pathogens. Therefore，it delayed the occurrence and development of spleen deficiency to a certain extent，indicating that the medicine had immune regulation effect，with considerable clinical value and application prospects.

[Key words] HIV/AIDS；Chinese medicine；immune regulation

眾所周知，抗病毒藥有諸多的局限性：病毒突變，產(chǎn)生耐藥；病毒潛伏，藥物無法發(fā)揮作用；一旦停藥，病毒載量很快就大幅攀升；毒副作用明顯，治療方案復(fù)雜。因此研制毒副作用小的新藥，既有益于患者，也有助于防止疾病進(jìn)一步傳播。中醫(yī)藥有很大發(fā)展空間，因為除了抗病毒治療，保護(hù)機體的免疫細(xì)胞生成和成熟的組織環(huán)境，本身就是一種治療，中藥提取物成分復(fù)雜，為實現(xiàn)多環(huán)節(jié)、多靶點的調(diào)節(jié)奠定了基礎(chǔ)。中藥艾可清作為艾滋病的關(guān)愛制劑，在臨床上獲得了良好的效果，前期研究表明，它能提高患者的生存質(zhì)量，并延緩HIV感染者進(jìn)入艾滋病期。故本研究將通過觀察健脾補腎解毒法中藥對猴艾滋病模型的免疫調(diào)節(jié)作用，做進(jìn)一步的研究，以期探索中藥的優(yōu)勢所在。

1 材料與方法

1.1 動物 中國產(chǎn)恒河猴8只，全部為雄性。體重4.99～8.14 kg，猴齡4～6歲，動物由廣東靈長類實驗動物中心提供，許可證號SCXK（粵）2009-0025。試驗前經(jīng)血清學(xué)檢測SIV、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒（SRV）、猴T淋巴細(xì)胞I型病毒（STLV-I）和B病毒抗體陰性，結(jié)核菌素陰性，痢疾菌素陰性。以蒸餾水及標(biāo)準(zhǔn)猴飼料為飲食，喂飼于高要市康達(dá)實驗動物中心獲GLP認(rèn)證的靈長類動物實驗室。本實驗經(jīng)廣東省靈長類動物實驗中心動物倫理委員會批準(zhǔn)（文件編號113009-IACUC），實驗嚴(yán)格按照廣東省靈長類動物實驗中心標(biāo)準(zhǔn)操作/作業(yè)流程執(zhí)行。

1.2 感染毒株及途徑 SIVmac239，中國科學(xué)院昆明動物所鄭永唐博士饋贈，5MID100（5個100%猴感染劑量）1 mL靜脈注射。

1.3 給藥方案 本研究所用中藥為經(jīng)臨床觀察和猴艾滋病研究證實有效的艾可清復(fù)方[1]加味，本方以艾可清加七味白術(shù)散為基礎(chǔ)，其組成如下：紅參10 g，黃芪20 g，白術(shù)15 g，茯苓10 g，當(dāng)歸10 g，藿香10 g，木香6 g，葛根6 g，虎杖15 g，毛冬青15 g，黃芩10 g，紫草10 g，淫羊藿15 g，骨碎補10 g，丹參15 g，炮附子6 g，甘草6 g，地榆30 g。制成中藥混懸液灌胃；抗病毒藥治療組將PMPA按照30 mg·kg^-1的劑量皮下注射于動物背部；各組均為每天1次，共給藥8周。分別在給藥0，4，8周采集外周血檢測各項指標(biāo)。

抗病毒藥物PMPA（GILEAD GS-1278），9-R-2-Phosphonomethoxypropyl adenine，商品名Tenofovir。配制方法：以蒸餾水溶解至100 g·L^-1，再以NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，0.2 μm過濾，分裝凍存（短期內(nèi)可保存于4 ℃）。

1.4 血漿SIV病毒載量測定 采集EDTA抗凝全血，分離血漿凍存；按照本課題組已發(fā)表的方法，采用自制一管式體液病毒核酸抽提試劑[2]，采用Real-time PCR TaqMan探針法測定。引物及TaqMan探針序列為： SIVprobe：FAM-ACTATGTCCACCTGCCATTAAGCCCGAGA-TAMRA；SIVsense：GGAGGAAATTACCCAGTACAACAAAT；SIVantisense：CCTGAAATCCTGGCACTACTTCT。ABI 7500 Real-time PCR儀檢測。

1.5 外周血淋巴細(xì)胞亞群的檢測 用熒光標(biāo)記單克隆抗體CD3-APC（SP34-2），CD4-PERCP（L200），CD8-PE（RPA-T8），CD28-FITC（CD28.2），CD45RA-FITC（5H9）均購自美國BD公司；用流式細(xì)胞儀（BDFACS Calibur）檢測和分析。最后結(jié)合血常規(guī)的結(jié)果，計算各亞群細(xì)胞的絕對數(shù)。

1.6 血常規(guī)和血生化指標(biāo) 血常規(guī)包括白細(xì)胞（WBC）、淋巴細(xì)胞（LYM）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT），用HORIBA ABX PENTRA 60全自動血細(xì)胞分析儀測定；血生化包括谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、血清尿素氮（BUN）、肌酐（CREA），采用EX-3600全自動生化儀測定。

1.7 T3，T4，Cor，β2-MG指標(biāo)檢測 試劑盒由北京北方生物技術(shù)研究所提供，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)核醫(yī)學(xué)實驗室使用上海原子核所日環(huán)儀器一廠放免γ測量儀進(jìn)行檢測。

1.8 LPS檢測 用ELISA法檢測，試劑盒Multispecies Enzyme Immunoassay for Quantification of free human LBP（Cat.No 044a，Lot：080814），購自Biometec Company for Biomedical Technologies。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)建立及分析，用配對t檢驗比較同組前后各指標(biāo)的差異，用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析比較重復(fù)測量數(shù)據(jù)的時間效應(yīng)和處理因素對各指標(biāo)影響的大小。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 中藥組和抗病毒藥組動物感染SIVmac239時間均為2013年9月5日，進(jìn)入本研究時均為感染后15月。治療前基線狀況一致，有可比性，見表1。

治療過程中臨床表現(xiàn)：中藥治療組558號猴給藥前經(jīng)常反復(fù)腹瀉，給藥后腹瀉減輕，食欲有改善，但依然有腹瀉，在給藥45 d后死亡，解剖所見：消瘦、脫水，左右肺臟輕度淤血，氣腫、腹腔有粘連，大腸黏膜充血；抗病毒藥組給藥7 d后532號和535號猴出現(xiàn)腹瀉，540號猴給藥7 d后死亡，尸體解剖發(fā)現(xiàn)：消瘦、脫水，左右肺葉灰紅色腫大，質(zhì)地變實，肺葉間有粘連，大腸脹氣。537號猴在停藥21 d后死亡，解剖所見：消瘦，左右肺葉淡褐色腫大，質(zhì)地變實。考慮540號猴給藥時間短，僅7 d，其藥物作用效果尚未體現(xiàn)，以下結(jié)果數(shù)據(jù)中均不包含該猴。由于艾滋病猴的個體差異大，且樣本量少，有些數(shù)據(jù)無法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，只能得出其變化趨勢。治療過程中體重的變化見圖1。經(jīng)配對t檢驗，抗病毒藥治療組給藥8周與給藥前相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），相比中藥組，抗病毒藥組體重下降幅度更大。

2.2 安全性評價 治療過程中，以血常規(guī)和血生化指標(biāo)的變化，作為用藥安全性評價，見表2，3，各指標(biāo)參考范圍見國家“十一五”科技重大專項（抗HIV中藥復(fù)方優(yōu)化及中醫(yī)動物模型研究，2008ZX10005-005）中制定的參考值范圍[3]。經(jīng)重復(fù)測量資料的方差分析，WBC，LYM，RBC，HGB和PLT時間效應(yīng)和分組效應(yīng)P均大于0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義，可認(rèn)為WBC，LYM，RBC，HGB和PLT各個時間點和組間無明顯差異。治療過程中，中藥組血常規(guī)各項指標(biāo)均在正常參考值范圍內(nèi)，而抗病毒藥組WBC和PLT治療8周時高于正常參考值范圍，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

經(jīng)重復(fù)測量資料的方差分析，CREA，BUN，AST和ALT時間效應(yīng)和分組效應(yīng)P均大于0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義，可認(rèn)為CREA，BUN，AST和ALT各個時間點和組間無明顯差異。治療過程中中藥組血生化各項指標(biāo)保持正常，其中CREA治療前高于正常參考值范圍，治療后歸于正常；而抗病毒藥組治療過程中4項生化指標(biāo)均有不同程度異常。

2.3 病毒學(xué)方面 中藥組血漿病毒載量保持穩(wěn)定，輕度升高；抗病毒藥組顯著下降，但經(jīng)重復(fù)測量資料的方差分析，病毒載量的時間效應(yīng)和分組效應(yīng)P均大于0.05，可以認(rèn)為各時間點和組間病毒載量的變化沒有明顯差異，見表4和圖2。

2.4 免疫學(xué)方面 各組治療前后T淋巴細(xì)胞亞群的變化：經(jīng)重復(fù)測量資料的方差分析，CD4和CD8數(shù)量的時間效應(yīng)和分組效應(yīng)P均大于0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義，可認(rèn)為中藥組和抗病毒藥組各個時間點和組間無明顯差異。中藥組CD4數(shù)量顯著上升，抗病毒藥組CD4數(shù)量保持穩(wěn)定，未見上升；2組CD8數(shù)量均有升高，抗病毒藥組升高幅度更大。經(jīng)配對t檢驗，中藥組治療4周的CD4數(shù)量和抗病毒藥組治療4周CD8數(shù)量與給藥前相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表5。

各組治療前后T細(xì)胞純真亞群和記憶亞群的變化：經(jīng)重復(fù)測量資料的方差分析，2組T細(xì)胞純真亞群和記憶亞群細(xì)胞數(shù)量的差異在時間和組間均無統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)配對t檢驗，相比治療前，中藥組CD4純真細(xì)胞治療4周時顯著升高（P<0.05）；而抗病毒藥組CD8純真細(xì)胞治療4周相比治療前亦顯著升高（P<0.05），見表6。

各組治療前后T細(xì)胞功能亞群的變化：經(jīng)重復(fù)測量資料的方差分析，2組T細(xì)胞功能亞群數(shù)量的差異在時間和組間均無統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)配對t檢驗，相比治療前，中藥組CD8殺傷性細(xì)胞（CD8+CD28+）治療4周時顯著升高（P<0.05），見表7。

2.5 SIV猴模型血清內(nèi)毒素LPS的變化 血清內(nèi)毒素LPS：中藥組治療前中位數(shù)為19.22 μg·L^-1，治療后為32.32 μg·L^-1；抗病毒藥組治療前中位數(shù)為11.50 μg·L^-1，治療后為11.30 μg·L^-1。經(jīng)兩獨立樣本的t檢驗，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.6 中醫(yī)證候指標(biāo)方面 治療過程中2組的T3均出現(xiàn)下降；中藥組T4輕度升高，抗病毒藥組T4顯著下降組間差異顯著（P<0.05）；2組的β2-MG均升高。各指標(biāo)參考范圍參考國家“十一五”科技重大專項（抗HIV中藥復(fù)方優(yōu)化及中醫(yī)動物模型研究，2008ZX10005-005）中制定的參考值范圍[3]，見表8。

3 討論

HIV/AIDS所表現(xiàn)出來的納差、腹瀉、消瘦以及諸多的并發(fā)癥大多屬于脾胃氣虛，健運失常，中氣下陷，后天衰敗，諸證蜂起的病證。在猴艾滋病實驗研究中也發(fā)現(xiàn)，隨著疾病進(jìn)展，實驗猴紛紛出現(xiàn)腹瀉、體重下降、攝食改變等脾虛癥狀，AIDS期出現(xiàn)精神疲倦、蜷縮怕冷、甚至部分水腫、毛發(fā)脫落等脾腎俱虛癥狀。本研究所用的健脾補腎解毒法方藥以艾可清加七味白術(shù)散為基礎(chǔ)，七味白術(shù)散配黃芪補中益氣，芳香醒脾，斡旋中焦氣機，恢復(fù)脾胃升清降濁功能，為君藥，扶正以固本；虎杖、毛冬青、黃芩、紫草為臣藥，清熱解毒以治標(biāo)；淫羊藿、骨碎補、炮附子補命門之火以溫煦脾土，丹參、當(dāng)歸補血活血，預(yù)防久病氣滯血瘀，共為佐；甘草調(diào)和諸藥為使。

本研究首先對健脾補腎解毒方藥的安全性進(jìn)行了考察。在為期8周的給藥過程中，2組實驗猴的平均體重均逐漸下降，其中HAART組體重下降幅度略大。此外，HAART組在治療過程中BUN，ALT指標(biāo)的均有所增高、并高出正常上限。而中藥組血常規(guī)和血生化各項指標(biāo)均在正常參考值范圍內(nèi)，提示中藥不會導(dǎo)致肝、腎功能的損傷。隨后，按照常規(guī)程序，根據(jù)治療前、后血漿病毒載量、CD4的改變情況來評價該方藥的療效。發(fā)現(xiàn)，該方藥雖然對受試動物的血漿病毒載量無明顯影響，但CD4的絕對數(shù)較治療前有明顯提升（P<0.05）。這一改變也使得CD4/CD8的比例有增高的趨勢。此結(jié)果提示，該方藥確有提高CD4細(xì)胞數(shù)的臨床價值。為了進(jìn)一步評價改變CD4的特性，檢測了CD4，CD8表達(dá)CD45RA的情況。研究發(fā)現(xiàn)，治療后純真T細(xì)胞（CD4+CD45RA+）的數(shù)量明顯增加。而CD4+純真細(xì)胞的增長是公認(rèn)的治療后真正意義上的免疫重建。臨床上純真T細(xì)胞的升高多在經(jīng)過HAART治療后一年或更晚些時候發(fā)生，這也正是許多機會性感染雖經(jīng)抗病毒治療仍然發(fā)生的一個重要因素。因此，能快速提升純真T淋巴細(xì)胞水平，更體現(xiàn)出健脾補腎解毒方藥在免疫重建中的價值。接下去以CD28的表達(dá)情況來初步評價中藥治療對T細(xì)胞功能可能的影響。結(jié)合文獻(xiàn)，主要關(guān)注CD4+CD28+亞群，與慢性HIV-1感染中對抗原的免疫應(yīng)答有關(guān)[4]，以及CD8+CD28+亞群[5]。研究發(fā)現(xiàn)，中藥治療組CD4+CD28+和CD8+CD28+（P<0.05）數(shù)量均有增加，提示治療后CD4和CD8的功能得到增強，該中藥可能改善了感染動物對病原體的免疫應(yīng)答。

結(jié)合文獻(xiàn)，腸菌移位后血清內(nèi)毒素LPS升高，而且在艾滋病進(jìn)展中，必須有病毒復(fù)制存在，LPS才會升高[6-7]。本研究中，中藥組治療后LPS中位數(shù)輕度升高，提示病毒復(fù)制仍在增加，但CD4和CD4純真細(xì)胞數(shù)量均上升，推測這可能是實驗室和臨床上，出現(xiàn)病毒載量沒有下降，但實驗動物與HIV/AIDS患者仍然表現(xiàn)出癥狀改善，生存質(zhì)量提高的原因?？共《舅幗M治療前后LPS中位數(shù)持平，提示抗病毒藥一定程度上抑制了病毒復(fù)制，推測可能與CD8和CD8純真細(xì)胞數(shù)量升高有關(guān)。這也與中藥和抗病毒藥作用機制不同一致：中藥組重在增強免疫重建，抗病毒藥組重在殺傷抑制病毒。

本研究中，中藥治療組出現(xiàn)1只死亡猴，抗病毒藥組出現(xiàn)2只死亡猴?？共《舅幠軓娪辛Φ匾种撇《緩?fù)制，但有個體差異：研究中540號猴在給藥7 d后死亡，537號猴對抗病毒藥不敏感，血漿病毒載量一直處于比較高的水平，最后死亡；而另外2只猴對抗病毒藥比較敏感：治療后532號猴病毒載量降低1.5Log，535號猴甚至降至“測不到”的水平。臨床上同樣如此，HIV/AIDS患者使用抗病毒藥物治療后，部分患者血漿病毒載量能較快降至“測不到”的水平，部分患者病毒復(fù)制卻一直活躍。中藥組血漿病毒載量沒有明顯下降，提示該藥抗病毒力度不夠，但除1只平素反復(fù)腹瀉的558號猴死亡外，其余3只猴存活良好，提示對于免疫系統(tǒng)衰弱的艾滋病晚期猴，免疫重建的重要性絲毫不遜色于抑制病毒復(fù)制，此時以壓制病毒為優(yōu)勢的HAART治療并沒有中藥效果好。

中醫(yī)證候指標(biāo)方面，納入研究的血清T3 （三碘甲腺原氨酸）、T4 （甲狀腺素）、Cor（皮質(zhì)醇）和β2-MG（β2微球蛋白）[8-11]均為反映猴艾滋病模型中醫(yī)脾虛證候和腎虛證候的指標(biāo)，治療過程中2組的T3均出現(xiàn)下降，提示出現(xiàn)脾虛證候；中藥組T4輕度升高，抗病毒藥組T4顯著下降，組間差異顯著（P<0.05），提示相比抗病毒藥組，中藥組一定程度上減緩了脾虛的進(jìn)程；而已證明與HIV感染及其進(jìn)展相關(guān)的β2-MG[12]在2組均升高，提示艾滋病在進(jìn)展，而且腎虛證候也開始出現(xiàn)。

綜上所述，健脾補腎解毒法中藥雖然不能像HAART一樣明顯降低血漿病毒載量，但可以升高外周血CD4，該亞群主要為CD4純真細(xì)胞；使CD4和CD8功能細(xì)胞數(shù)量增加，增強對病原體的免疫應(yīng)答；且在一定程度上延緩了脾虛的出現(xiàn)和發(fā)展，均顯示了該藥有比較好的免疫調(diào)節(jié)作用，有相當(dāng)?shù)呐R床價值和應(yīng)用前景。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]