代金霞+杜曉寧

[摘要] 為篩選具有抗菌抗腫瘤活性的枸杞內(nèi)生菌資源，對分離自寧夏枸杞的10株內(nèi)生菌發(fā)酵液的抑菌活性和體外細(xì)胞毒活性進(jìn)行檢測，通過ITS 和16S rDNA序列分析對菌株進(jìn)行了分子鑒定。結(jié)果表明，5株內(nèi)生真菌對供試病原菌都未表現(xiàn)出抑制活性，放線菌AL6對3種病原真菌都有一定的抑制作用，而AL5僅對金黃色葡萄球菌有較強抑制活性。但內(nèi)生真菌的抗腫瘤活性明顯強于放線菌。當(dāng)發(fā)酵液濃度為0.2 g·L^-1時，有4株內(nèi)生真菌至少對1種腫瘤細(xì)胞的抑制率高于50%。序列分析表明，5株內(nèi)生真菌隸屬于曲霉屬、青霉屬和翹孢霉屬。5株內(nèi)生放線菌隸屬于鏈霉菌屬、微球菌屬和擬諾卡氏菌屬。曲霉屬菌株FL1對A549和HeLa細(xì)胞的抑制活性都較強，其IC₅₀分別為0.022，0.028 g·L^-1，值得進(jìn)一步研究。

[關(guān)鍵詞] 枸杞；內(nèi)生菌；抑菌活性；抗腫瘤活性

[Abstract] The antimicrobial activity and cytotoxicity in vitro of the fermentation broth of 10 endophytic strains isolated from Lycium barbarum were determined to screen high activity endophytic strains. Sequences analysis of ITS and 16S rDNA was used for molecular identification of the strains. The results showed that 5 endophytic fungi had no inhibitory activity against the tested pathogens. Endophytic actinomycete strain AL6 had a certain inhibitory effect on 3 kinds of pathogenic fungi，and strain AL5 only had strong inhibitory activity against Staphylococcus aureus. However，the anti-tumor activity of endophytic fungi was significantly higher than that of actinomycetes. Four endophytic fungi strains exhibited the growth inhibition rate of above 50% against at least one of the tested tumor cells when the concentration of fermentation broth was 0.2 g·L^-1. Sequences analysis showed that 5 endophytic fungi strains belonged to genus Aspergillus，Penicillium and Emericella，and the 5 endophytic actinomycetes strains belonged to genus Aspergillus，Penicillium and Emericella. Aspergillus strain FL1 had stronger inhibitory activity against A549 and HeLa cells，and the IC₅₀ values were 0.022，0.028 g·L^-1，respectively，which was worthy of further study.

[Key words] Lycium barbarum；endophytes；anti-microbial activities；anti-tumor activities

內(nèi)生菌（endophyte）是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部，而不使宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物[1]。植物內(nèi)生菌在植物微生態(tài)系統(tǒng)中，與宿主建立了和諧的聯(lián)合關(guān)系，不僅能夠參與植物次生代謝及成分的轉(zhuǎn)化合成，而且還能夠獨立產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，是天然產(chǎn)物的重要來源[2]。藥用植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物含有與宿主植物相同或相似的藥用活性成分，包括抗腫瘤、抗菌、抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)、降糖等天然化合物[3]。直到現(xiàn)在人們已發(fā)現(xiàn)微生物的代謝產(chǎn)物中有60余種藥理作用[4]。尤其是近10年來關(guān)于微生物代謝產(chǎn)物的研究越來越受到人們的重視，并且也取得了極為驚人的研究成果。目前藥用植物內(nèi)生菌已成為人們尋找新型藥物的重要來源。內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物已作為抗癌藥物、抑菌劑、植物激素、殺蟲劑、抗氧化劑等服務(wù)于人類[5-6]。

枸杞Lycium barbarum L.為茄科多年生落葉小灌木，花、果、葉、根皮均可入藥，有很高的營養(yǎng)價值和藥用保健功效，不僅是我國傳統(tǒng)的藥用植物，也是重要的經(jīng)濟資源。寧夏產(chǎn)枸杞因其品質(zhì)優(yōu)良成為全國首推的藥用枸杞，被《中國藥典》收錄為大宗道地性中藥材。而內(nèi)生菌與宿主植物在長期共進(jìn)化過程中形成了穩(wěn)定的互利共生關(guān)系，次生代謝產(chǎn)物是這種關(guān)系的物質(zhì)基礎(chǔ)[7]。目前對于枸杞內(nèi)生菌的相關(guān)研究極少，其代謝產(chǎn)物是否具備與宿主植物相同或相似的活性成分，是否具有潛在的藥用價值尚未可知。本研究擬以前期分離自寧夏枸杞的5株內(nèi)生真菌和5株內(nèi)生放線菌為供試菌株，以5種病原菌為指示菌對菌株的抑菌活性進(jìn)行測定，以2種腫瘤細(xì)胞為指示細(xì)胞對菌株的體外細(xì)胞毒活性進(jìn)行檢測，篩選具有抗菌抗腫瘤活性的菌株，旨在了解枸杞內(nèi)生菌的生物學(xué)特性及其未知的藥理學(xué)作用，為開發(fā)枸杞內(nèi)生菌資源、獲得能夠產(chǎn)生藥用功能性成分的內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物提供基礎(chǔ)資料。

1 材料

1.1 內(nèi)生菌

分離自寧夏枸杞的5株內(nèi)生真菌和5株內(nèi)生放線菌。其中內(nèi)生真菌FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L6和FL9分離自枸杞嫩葉，F(xiàn)R4B分離自枸杞根皮；內(nèi)生放線菌AF16分離自枸杞花，AL1B，AL3，AL5，AL6分離自枸杞嫩葉。

1.2 致病菌

動物病原細(xì)菌包括大腸桿菌Escherichia coli和金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus；植物病原真菌包括玉米大斑病菌Exserohilum turcica、小麥赤霉病菌Fusarium graminearum和番茄炭疽病菌Colletotrichum nigrum，由寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院和農(nóng)學(xué)院保存。

1.3 細(xì)胞株

腫瘤細(xì)胞株包括人宮頸癌細(xì)胞株HeLa和人肺腺癌細(xì)胞株A549，以正常細(xì)胞人胚肺成纖維細(xì)胞株MRC-5為對照。

1.4 試劑

胎牛血清（北京全式金生物有限公司）、二甲基亞砜 （DMSO，美國Sigma公司）、1640培養(yǎng)基（美國，Hyclone 公司）、細(xì)胞完全培養(yǎng)基（1640培養(yǎng)基：胎牛血清= 9∶1）；MTT（噻唑藍(lán)）溶液：稱取100 mg MTT粉末，溶于20 mL PBS溶液中，用0.22 μm微孔濾膜過濾后分裝在5個2 mL的無菌離心管中，封口膜封口，-20 ℃避光保存。

2 方法

2.1 抑菌活性檢測

將保存的枸杞內(nèi)生菌、指示菌分別接種于NA、高氏I號和PDA平板上進(jìn)行活化后，挑取單菌落或菌絲接種于250 mL相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，在28 ℃，120 r·min^-1條件下震蕩培養(yǎng)3～7 d，將菌懸液在8 000 r·min^-1離心 5 min，取上清液備用。

采用抑菌圈法對菌株的抑菌活性進(jìn)行檢測。取200 μL指示細(xì)菌和真菌發(fā)酵液分別注入NA和PDA平板中，用滅菌的涂布棒均勻涂布于平板上，干燥后用打孔器在培養(yǎng)基表面均勻打3～4個直徑為6.0 mm的孔，取80 μL供試內(nèi)生菌的發(fā)酵上清液接于孔內(nèi)，每皿接2～3株，分別以滅菌的PDA和高氏I號培養(yǎng)液為陰性對照，每組實驗設(shè)置3次重復(fù)。于28 ℃培養(yǎng)3～7 d觀察并測量抑菌圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）。

2.2 抗腫瘤活性測定

將供試菌株發(fā)酵液經(jīng)凍融、勻漿后，8 000 r·min^-1離心 10 min，上清液用 0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，經(jīng)減壓濃縮成膏狀。分別稱取0.2 g膏狀發(fā)酵產(chǎn)物，用PBS緩沖液配置成20 g·L^-1的母液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，得到無菌備用液。用RPMI-1640基本培養(yǎng)基稀釋備用液至0.2 g·L^-1（內(nèi)生真菌）和2.0 g·L^-1（內(nèi)生放線菌），4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用體外細(xì)胞毒測定的MTT法和CCK-8法測定菌株發(fā)酵液的抗腫瘤活性。把培養(yǎng)好的HeLa，A549，MRC-5 細(xì)胞用完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸浮液，血球計數(shù)板計數(shù)，按5萬個/mL接種100 μL于96孔板，置CO₂培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12 h，待貼壁后吸掉原有培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含0.2 g·L^-1內(nèi)生真菌或2.0 g·L^-1內(nèi)生放線菌發(fā)酵液的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。以滅菌的完全培養(yǎng)基處理為陰性對照，每處理3次重復(fù)。

2.2.1 MTT法 上述處理后每孔加入MTT溶液（5 g·L^-1） 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，終止培養(yǎng)。小心吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO后震蕩10～15 min，使藍(lán)色結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀測定波長490 nm處的吸光值A(chǔ)₄₉₀。

2.2.2 CCK-8法 每孔加入CCK-8 Solution 10 μL，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h后終止培養(yǎng)。用酶標(biāo)儀測定450 nm的吸光度A₄₅₀。用以下公式計算樣品對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率。用改良的寇氏法計算IC₅₀。

2.3 發(fā)酵液梯度活性測定

對篩選出的具有較強抗腫瘤活性的菌株進(jìn)行濃度梯度活性測定。將保存的無菌備用液用完全培養(yǎng)基分別配置成濃度梯度為0.5，0.4，0.3，0.2，0.1 g·L^-1的待測液，采用CCK-8法進(jìn)行抗腫瘤梯度活性試驗。分別于處理 24，48 h時用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞株形態(tài)變化。用改良的寇氏法計算樣品的IC₅₀（即抑制率為50%時的樣品濃度）。用IBM SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.4 菌株的分子鑒定

提取各菌株基因組DNA，采用引物對ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴增內(nèi)生真菌的ITS序列，用引物對27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）擴增內(nèi)細(xì)菌的16S rDNA序列。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行blast同源性搜索，用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的分類地位。

3 結(jié)果與分析

3.1 枸杞內(nèi)生菌的抑菌活性

抑菌實驗結(jié)果表明，5株枸杞內(nèi)生真菌對所選病原菌均未表現(xiàn)出抑制活性。而內(nèi)生放線菌中，菌株AL6對番茄炭疽病菌、玉米大斑病菌、小麥赤霉病菌的生長都有一定抑制作用，抑菌圈與菌落直徑比值（D/d）分別為2.31，2.45，3.92，但對2種動物病原細(xì)菌沒有抑制作用；菌株AL5僅對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較強的抑制活性，D/d達(dá)到3.98；其余菌株對各病原菌均無抑制活性（圖1）。

3.2 枸杞內(nèi)生菌的抗腫瘤活性

本研究采用 MTT法與CCK-8法，以腫瘤細(xì)胞HeLa和A549為指示細(xì)胞株，對10株枸杞內(nèi)生菌發(fā)酵物的體外細(xì)胞毒活性進(jìn)行分析。2種方法的測定結(jié)果基本一致，而CCK-8法操作更為簡便，且靈敏度略強。當(dāng)內(nèi)生真菌發(fā)酵液濃度為0.2 g·L^-1時，有4株內(nèi)生真菌對2種腫瘤細(xì)胞的生長均具有抑制作用（表1）。其中菌株FL1和FL6對HeLa和A549的抑制活性都較強，抑制率分別達(dá)到78.8%，89.2%和65.7%，55.7%；菌株FL2對HeLa細(xì)胞有明顯的抑制作用，抑制率為71.2%，而FL9則對A549細(xì)胞的生長抑制率為51.8%；FR4B對HeLa細(xì)胞的生長沒有抑制作用，對A549的抑制作用也不明顯。

內(nèi)生放線菌發(fā)酵液濃度為2.0 g·L^-1時，僅菌株AL6和AL5對HeLa細(xì)胞、AL1B對A549有一定的抑制作用，其余菌株對供試腫瘤細(xì)胞均未表現(xiàn)出抑制活性。總體上看，枸杞內(nèi)生真菌對供試腫瘤細(xì)胞的抑制活性明顯強于內(nèi)生放線菌。

3.3 內(nèi)生菌發(fā)酵液梯度活性

根據(jù)各菌株的抗腫瘤活性結(jié)果，選取對2種腫瘤細(xì)胞均具有抑制活性的4株內(nèi)生真菌進(jìn)行梯度活性試驗。結(jié)果表明內(nèi)生真菌發(fā)酵液濃度與其對腫瘤細(xì)胞的抑制活性成線性正相關(guān)關(guān)系，即隨著濃度的不斷增大，對腫瘤細(xì)胞的抑制活性也不斷增強（圖2）。4株內(nèi)生真菌對HeLa細(xì)胞抑制濃度的IC₅₀為0.028～0.388 g·L^-1，抑制活性表現(xiàn)為FL1>FL2>FL6>FL9。對腫瘤細(xì)胞A549抑制濃度的IC₅₀為0.022～0.373 g·L^-1，抑制活性表現(xiàn)為FL1>FL9>FL6>FL2；其中菌株FL1對2株腫瘤細(xì)胞的抑制活性均最強，其IC₅₀分別為0.022，0.028 g·L^-1（表2）。

比較細(xì)胞毒活性最強的菌株FL1對腫瘤細(xì)胞A549，HeLa和正常細(xì)胞MRC-5生長的影響。在各細(xì)胞貼壁12 h后，用0.5 g·L^-1的 FL1代謝產(chǎn)物進(jìn)行處理，用完全培養(yǎng)基處理做陰性對照，分別于處理24，48 h后觀察各細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果表明在處理24 h時，實驗組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞核變大，細(xì)胞形態(tài)明顯分化，細(xì)胞變薄，顏色變深，數(shù)目沒有增多，而對照組細(xì)胞形態(tài)正常，數(shù)量增多。處理48 h后，實驗組細(xì)胞形態(tài)進(jìn)一步異化，HeLa細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，而A549的細(xì)胞核明顯變圓變大，細(xì)胞形態(tài)明顯分化變形，出現(xiàn)凋亡跡象，對照組細(xì)胞形態(tài)沒有明顯變化，數(shù)量進(jìn)一步增多。而相同濃度的代謝產(chǎn)物對正常細(xì)胞MRC-5的形態(tài)與數(shù)量均沒有明顯影響（圖3）。

3.4 菌株的鑒定

通過序列測定，獲得5株枸杞內(nèi)生真菌約500 bp左右ITS序列，5株放線菌約1 400 bp的16S rDNA序列。系統(tǒng)發(fā)育分析表明（圖4），內(nèi)生真菌FL1，F(xiàn)L6，F(xiàn)L9隸屬于曲霉屬Aspergillus，分別與該屬A. fumigatus，A. flavus和A. tubingensis聚為一支；菌株FR4B屬于青霉屬Penicillium，與P. chrysogenum的序列相似性為99%；FL2則與翹孢霉Emericella quadrilineata聚為一支。內(nèi)生放線菌AL5，AL6和AL1B隸屬于鏈霉菌屬Streptomyces，與鏈霉菌屬參比菌株Streptomyces sp.，S. lividans 和S. badius 以99%～100%的序列相似性聚為一支；EAF16和AL3分別隸屬于微球菌屬Micrococcus和擬諾卡氏菌屬Nocardiopsis屬，與二者有著高的序列相似性。

4 討論

內(nèi)生菌在與宿主植物長期的協(xié)同進(jìn)化過程中形成了密切的關(guān)系，而維持這種關(guān)系的物質(zhì)基礎(chǔ)是內(nèi)生菌產(chǎn)生的或由其誘導(dǎo)宿主植物合成的次生代謝產(chǎn)物。內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的研究對于闡明生物進(jìn)化的機制，加深對生物體之間競爭與生存關(guān)系的了解以及豐富微生物多樣性均具有重要的意義。目前對植物內(nèi)生菌的研究顯示，約有30%的內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生具有抗菌活性的物質(zhì)，對多種病原菌具有廣譜或?qū)Ｒ豢剐訹8]。本研究對枸杞內(nèi)生菌的抑菌活性結(jié)果表明，供試的5株內(nèi)生真菌對供試病原菌均未表現(xiàn)出抑制活性，僅有2株鏈霉菌屬菌株對部分病原菌的生長有一定抑制作用，但抑菌活性不強。內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物的活性因菌株不同而有很大差異，即使同屬的菌株其活性也大不相同，如鏈霉菌屬的AL5，AL6和AL1B，菌株AL6對3種病原真菌都表現(xiàn)出抑制作用，菌株AL5僅對金黃色葡萄球菌有抑制活性，而AL1B則對所有病原菌都未表現(xiàn)出抑制活性。蘇林涓等[9]、張志斌等[10]分離自茶樹和野生稻的鏈霉菌對許多病原菌的生長都具有較強的抑制作用，表現(xiàn)出廣譜的抑菌活性。王營等[11]從廣藿香中分離的曲霉屬菌株具有廣譜抗菌活性；而劉雷[12]分離自川麥冬的曲霉屬菌株僅對白色念珠菌具有抑制活性，對其他動物病原細(xì)菌則無抑制作用；這些研究結(jié)果表明，植物內(nèi)生菌對不同病原菌的抑制作用既表現(xiàn)出一定的選擇性，也具有專一性。

抗腫瘤實驗結(jié)果表明，枸杞內(nèi)生真菌具有較強的細(xì)胞毒活性，對腫瘤細(xì)胞的抑制效果明顯強于放線菌。尤其是曲霉屬菌株FL1，對2種供試腫瘤細(xì)胞都表現(xiàn)出強的細(xì)胞毒活性。王胤等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，煙曲霉對人肺癌A549細(xì)胞的生長有明顯的抑制活性，而且活性成分主要存在于胞內(nèi)；在本研究中曲霉屬菌株FL1的胞外次級代謝產(chǎn)物中具有抗腫瘤活性成分，這與陳傳文等[14]的研究結(jié)果一致。這表明不同藥材基因型和同種異質(zhì)對內(nèi)生菌的功能具有一定的影響。內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的多樣性可導(dǎo)致其代謝功能的差異，也是內(nèi)生菌生物學(xué)作用多樣性的根本原因。許多內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物中所含的黃酮類化合物，能夠產(chǎn)生強的細(xì)胞毒活性，對腫瘤細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用[15-16]。而黃酮類物質(zhì)也是寧夏枸杞的主要活性成分之一，那么，本研究篩選出的對2種腫瘤細(xì)胞具有強抑制活性的內(nèi)生真菌FL1，其活性成分是否與其宿主的代謝產(chǎn)物黃酮類相關(guān)，還值得進(jìn)一步研究。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]