王銀+劉芙蓉+向虹霖+卿紅+陳晨+毛聲俊+李慧

[摘要] 研制CD123單抗修飾的載丹參酮Ⅱ_A免疫脂質(zhì)體（CD123-TanⅡ_A-ILP），以期實現(xiàn)對白血病細胞的主動靶向給藥。采用正交試驗法優(yōu)化脂質(zhì)體處方，薄膜分散-探頭超聲法制備載丹參酮Ⅱ_A長循環(huán)脂質(zhì)體（TanⅡ_A-LP），以后插入法得到CD123-TanⅡ_A-ILP。流式細胞術(shù)檢測NB4細胞對脂質(zhì)體的攝取率，改良MTT法檢測CD123-TanⅡ_A-ILP對NB4細胞的增殖抑制作用。研究結(jié)果表明，NB4細胞對CD123單抗修飾的免疫脂質(zhì)體的攝取顯著高于對游離藥物及其載藥脂質(zhì)體的攝?。籘anⅡ_A，TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP與NB4細胞共培養(yǎng)48 h，其IC₅₀分別為20.87，11.71，7.17 μmol·L^-1。CD123-ILP有望為AML的治療提供新的靶向給藥策略。

[關(guān)鍵詞] 丹參酮Ⅱ_A；CD123；免疫脂質(zhì)體；NB4

[Abstract] In the study，we developed a novel formulation，CD123 mono-antibody （mAb） modified tanshinone Ⅱ_Aloaded immunoliposome （CD123-TanⅡ_A-ILP） to achieve the targeted drug delivery for leukemia cells. Orthogonal test was used to optimize liposome preparation，and the TanⅡ_A-loaded PEGylated liposomes （TanⅡ_A-LP） of S₁₀₀PC-Chol-（mPEG₂₀₀₀-DSPE）-TanⅡ_Aat 19∶5∶1∶1 molar ratio were prepared by the thin film hydration-probe ultrasonic method. A post-insertion method was applied to prepare CD123-TanⅡ_A-ILP via thiolated mAb conjugated to the terminal of maleimide-PEG₂₀₀₀-DSPE. The cellular uptake assay was measured by flow cytometry，and the inhibitory effect of CD123-TanⅡ_A-ILP on NB4 cells proliferation was tested by using MTT assay. The results of cellular uptake assay showed that CD123-ILP could significantly increase the drug uptake of NB4 cells as compared with free drugs and LP. The IC₅₀ values at 48 h incubation were 20.87，11.71，7.17 μmol·L^-1 respectively for TanⅡ_A，TanⅡ_A-LP and CD123-TanⅡ_A-ILP. CD123-ILP demonstrated a potential and promising targeted drug delivery strategy for acute myelogenous leukemia （AML） treatment.

[Key words] tanshinoneⅡ_A；CD123；immunoliposome；NB4

丹參酮Ⅱ_A（tanshinoneⅡ_A，TanⅡ_A）是中藥丹參根中的主要脂溶性成分，其具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性[1]。有研究表明，丹參酮Ⅱ_A可誘導腫瘤細胞分化、凋亡，抑制腫瘤的生長、增殖和侵襲性轉(zhuǎn)移[2]，其對白血病細胞株如K562[3]，NB4[4]，HL-60[5]等具有增殖抑制與促凋亡作用。

免疫脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)是當前腫瘤靶向治療領域的研究熱點之一。CD123系白介素-3受體（IL-3R）α鏈，為特異性高表達于急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）克隆性細胞及其干細胞表面的抗原，其可促進腫瘤細胞增殖、分化，并抑制細胞凋亡[6]。研究表明，CD123陽性表達率與AML患者的生存期呈負相關(guān)，提示不良預后，故CD123可作為預測復發(fā)率和生存率的評價指標[7-8]。由此可見，CD123為改善甚至根治AML提供了潛在的治療靶點[9]。據(jù)此，本研究首次嘗試研制CD123單抗（monoclonal antibody，mAb）修飾的載丹參酮Ⅱ免疫脂質(zhì)體（CD123-TanⅡ_A-ILP），以期為治療AML提供新的靶向給藥策略。

1 材料

PHS-3C pH計（上海雷磁儀器廠）；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申順生物科技有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；SK5200H型超聲儀（上海科導超聲儀器有限公司）；JY88-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝科器研究所）；微孔板恒溫振蕩器（杭州奧盛儀器有限公司）；Zetasizer Nano-ZS90粒度分析儀（英國Malvern）；安捷倫1100液相色譜儀（美國 Agilent）；IF-1型脂質(zhì)體擠出器、聚碳酸酯膜（100 nm）（加拿大Avestin）；CO₂細胞培養(yǎng)箱（日本SANYO）；CFM-500型倒置熒光顯微鏡（上海長方光學儀器廠）；Model-680酶標儀（美國BIO-RAD）；TDL-50B型低速臺式離心機（上海申安醫(yī)療器械廠）；FACSCalibur型流式細胞儀（美國BD Biosciences）。

TanⅡ_A（西安天豐生物科技有限公司，純度≥99%）；注射用大豆磷脂（S₁₀₀PC）、mPEG₂₀₀₀-DSPE（德國 Lipoid）；Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE（美國Avanti Polar Lipids）；膽固醇（Chol）（上?；菔郎噭┯邢薰荆?；BCA（Bicinchonininc acid）蛋白定量試劑盒、青霉素-鏈霉素溶液（江蘇凱基生物）；3-（2-吡啶二巰基）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（SPDP）（美國Pharmacia Biotech）；二硫蘇糖醇（DTT）、Ellman′s reagent（DTNB）、四甲基偶氮唑藍（MTT）、透析袋（MWCO，7000）（美國Sigma-Aldrich）；葡聚糖凝膠Sephadex-G50（瑞典Pharmacia）；交聯(lián)瓊脂糖凝膠Sepharose CL-4B（上海源葉生物）；RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Invitrogen Gibco）；鼠抗人CD123單克隆抗體（Clone 7G3）、鼠抗人CD123-APC、鼠IgG2a-APC（美國Becton Dickinson ）；AML細胞株NB4（American Type Culture Collection）；氯仿、甲醇、乙二胺四乙酸（EDTA）、二甲基亞砜（DMSO）為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TanⅡ_A-LP的處方優(yōu)化與制備

2.1.1 正交試驗設計篩選處方 在單因素試驗的基礎上，以包封率為指標，選取S₁₀₀PC與Chol的摩爾比（A）、藥脂比（B）、脂質(zhì)體濃度（C）作為考察因素，每個因素選取3個水平，見表1。

2.1.2 TanⅡ_A-LP的處方優(yōu)選 采用薄膜分散-探頭超聲法制備TanⅡ_A-LP[10]。分別稱取適量S₁₀₀PC，Chol，mPEG₂₀₀₀-DSPE，TanⅡ_A于混合溶液（氯仿-甲醇 2∶1）中，充分溶解后將其移入25 mL圓底燒瓶中，于37 ℃下減壓旋蒸15 min，除去有機溶劑，使成均勻脂膜，真空干燥4 h；加入適量磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）于上述圓底燒瓶中，超聲水化脫膜，于37 ℃條件下恒溫振蕩（200 r·min^-1）30 min，置冰水浴中探頭超聲100 s，整粒；續(xù)用脂質(zhì)體擠出器（聚碳酸酯膜100 nm）擠出TanⅡ_A-LP，重復20次，制得粒徑均一的載TanⅡ_A長循環(huán)脂質(zhì)體混懸液。取TanⅡ_A-LP上樣Sephadex-G50柱，以PBS進行洗脫，除去TanⅡ_A游離藥物。按不同處方制備的載藥脂質(zhì)體，實驗結(jié)果見表2。藥脂比是影響TanⅡ_A-LP包封率的主要因素，其次是S₁₀₀PC與Chol的摩爾比，脂質(zhì)體濃度對包封率的影響最小。篩選的最佳處方確定為A₂B₃C₃，即S₁₀₀PC-Chol 4∶1；藥脂比為1∶25；脂質(zhì)體濃度為12 mmol·L^-1。按優(yōu)化后的脂質(zhì)體處方連續(xù)制備3批TanⅡ_A-LP，其中S₁₀₀PC-Chol-（mPEG₂₀₀₀-DSPE）-Tan Ⅱ_A =19∶5∶1∶1，測得其包封率分別為89.2%，92.9%，91.4%。

2.2 CD123-TanⅡ_A-ILP的制備

首先將CD123 mAb巰基化，選用SPDP作為抗體巰基化試劑，DTT作為還原劑[11]。用DMSO配制SPDP溶液（25 mmol·L^-1），用醋酸鹽緩沖液（0.2 mmol·L^-1，pH 4.5，含5 mmol·L^-1 EDTA）配制DTT溶液（50 mmol·L^-1）。按CD123 mAb-SPDP=1∶10（摩爾比）混合，于室溫下緩慢振蕩1 h，制得CD123 mAb-PDP。透析法除去過量SPDP，醋酸鹽緩沖液（pH 4.5）為透析液。按（CD123 mAb-PDP）-DTT 1∶10（摩爾比）混合，于室溫充氮氣保護下反應30 min，透析除去DTT，透析液為PBS（含5 mmol·L^-1 EDTA），最終制得巰基化CD123 mAb。采用Ellmans法測定巰基化CD123抗體中的巰基量[12]，結(jié)果顯示[SH]/[CD123]≈5，即表明每個CD123 mAb分子可生成約5個巰基。量取適量Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE溶液（溶于氯仿）于25 mL圓底燒瓶中，60 ℃下真空旋蒸1 h形成薄膜。將巰基化CD123 mAb加入上述薄膜中[CD123 mAb-（Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE） 1∶10（摩爾比）]，超聲脫膜后封口置于微孔板恒溫振蕩器中，于25 ℃，200 r·min^-1條件下振蕩12 h。CD123 mAb上的巰基與Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE中的馬來酰亞胺基團中的雙鍵發(fā)生加成反應，形成CD123-PEG₂₀₀₀-DSPE膠束。按CD123 mAb-S₁₀₀PC 1∶400（摩爾比）向上述膠束中加入相應體積的TanⅡ_A-LP，于25 ℃，200 r·min^-1振蕩8 h，過凝膠CL-4B柱，以PBS為洗脫液，除去游離CD123-PEG₂₀₀₀-DSPE，即得CD123-TanⅡ_A-ILP。采用BCA蛋白定量試劑盒測定抗體連接率和抗體結(jié)合效率，具體操作按BCA試劑盒操作說明進行。根據(jù)7G3的相對分子質(zhì)量約150 kDa，每個脂質(zhì)體包含磷脂分子數(shù)約8萬，可計算脂質(zhì)體表面連接的抗體的密度[13]。計算公式如下： CD123 mAb連接率=（ILP中mAb含量/mAb加入量）×100%；CD123 mAb密度=[mAb摩爾量/mAb相對分子質(zhì)量（150 kDa）]/S₁₀₀PC摩爾量×8萬。計算結(jié)果顯示，CD123 mAb的連接率在45%～60%，CD123 mAb密度即每個脂質(zhì)體上抗體個數(shù)約48個。

2.3 CD123-TanⅡ_A-ILP的藥劑學特性表征

2.3.1 形態(tài)、粒徑及Zeta電位的測定 采用磷鎢酸負染，透射電鏡法觀察TanⅡ_A-LP，CD123-TanⅡ_A-ILP的形態(tài)，結(jié)果見圖1。分別取200 μL TanⅡ_A-LP及CD123-TanⅡ_A-ILP，用PBS稀釋10倍后，采用激光粒度分析儀（Zetasizer Nano-ZS90）測定脂質(zhì)體的粒徑、多分散系數(shù)（PDI）和 Zeta 電位。測得TanⅡ_A-LP粒徑為（105.3±2.5） nm，PDI為0.12±0.04，Zeta電位為（-24.5±1.2） mv；CD123-TanⅡ_A-ILP的粒徑為（113.3±3.5） nm，PDI為0.16±0.05，Zeta電位為（-34.8±1.8） mv。

2.3.2 包封率與載藥量的測定 采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定脂質(zhì)體的包封率和載藥量。取過柱后的TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP各100 μL，用PBS稀釋至1 mL，加入1 mL無水乙醇，用力振搖破壞脂質(zhì)體，靜置10 min，使脂質(zhì)體內(nèi)包載的TanⅡ_A充分溶解，溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，取濾液10 μL進樣HPLC，色譜條件見參考文獻[14]。按上述方法操作，測得脂質(zhì)體內(nèi)的藥物量MTan。另取含相同脂質(zhì)體量的未過柱分離的脂質(zhì)體溶液同法操作，測得藥物總量MTotal。包封率（EE）=（MTan/MTotal）×100%；載藥量=MTan/MLP×100%；MLP為載藥脂質(zhì)體的總質(zhì)量。根據(jù)上述計算公式，測得TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP的包封率分別為（91.2±1.5）%，（88.6±2.1）%（n=3）；載藥量為（1.36±0.02）%，（1.32±0.03）%。

2.3.3 脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察 將TanⅡ_A-LP與CD123-TanⅡ_A-ILP在4 ℃條件下保存，分別測定其在不同時間0，2，4，6，8，10，20，30 d的粒徑和藥物滲漏率，初步評價其物理穩(wěn)定性。于預先設定的時間點取樣200 μL脂質(zhì)體混懸液，過Sephadex-G50柱，除去游離TanⅡ_A。按2.3.2項下方法測定藥物含量，計算藥物滲漏率。結(jié)果顯示，放置10 d后制備的脂質(zhì)體中藥物滲漏率均不超過3%，30 d后脂質(zhì)體中藥物滲漏率均不超過5%；粒徑變化不顯著（P>0.05）；TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP溶液在各時間點均未見分層及凝聚現(xiàn)象，30 d時仍為均勻混懸液。

另外，考察TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP在PBS（pH 7.4）緩沖液中的穩(wěn)定性。分別取1 mL不同脂質(zhì)體制劑加入9 mL PBS，混合均勻，置于37 ℃恒溫箱中，在不同時間點0，4，8，12 h取1 mL混合液測定粒徑、PDI考察其穩(wěn)定性，見表3。由結(jié)果可知脂質(zhì)體在37 ℃的PBS中，隨時間推移，粒徑和PDI都略有上升，但變化不顯著（P>0.05）。由于溫度較高，TanⅡ_A隨時間變化緩慢釋放，沒有突釋現(xiàn)象。

2.4 NB4細胞對CD123-ILP的攝取

NB4細胞為AML細胞FAB-M3型，該類AML亞型患者的白血病細胞上高表達CD123，100%的病人呈陽性表達（N=9）[15]，據(jù)此作者確定選用NB4細胞作為CD123-ILP的靶細胞。為便于觀察與定量，在此項研究中作者選用熒光物質(zhì)香豆素-6（coumarin-6，Cou）為模型藥物，制備載香豆素-6脂質(zhì)體（Cou-LP）與載香豆素-6免疫脂質(zhì)體（CD123-Cou-ILP），采用流式細胞術(shù)檢測NB4細胞對Cou-LP，CD123-Cou-ILP的攝取差異。上述2種脂質(zhì)體的制備方法按2.1.2項操作。

收集對數(shù)期生長的NB4細胞，調(diào)整細胞密度至1×10⁶⁰個/mL，按每孔加入1 mL細胞接種于12孔板中。設置游離Cou，Cou-LP，CD123-Cou-ILP 3組，每組3個復孔。各組均稀釋至相同藥物濃度，每孔分別加入供試樣品溶液200 μL，37 ℃下孵育1 h，空白組加入等量RPMI-1640培養(yǎng)基。收集細胞，用預冷的PBS洗滌3次，除去未與細胞結(jié)合的藥物，加入200 μL PBS重懸，移置流式管中，混勻，上機檢測。實驗結(jié)果見圖2。由各組細胞中的藥物平均熒光強度（MFI）可知，NB4細胞對CD123-Cou-ILP的攝取量分別為游離Cou，Cou-LP的3.5，2倍（P<0.01），表明脂質(zhì)體經(jīng)CD123 mAb修飾后，可顯著增加靶細胞對其的攝取，有利于增加NB4細胞內(nèi)的藥物濃度。

2.5 NB4細胞增殖抑制作用考察

由于NB4細胞是懸浮細胞，因此采用改良MTT法[16]測定游離TanⅡ_A，TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP對其增殖抑制作用。TanⅡ_A用DMSO溶解，配制成30 mmol·L^-1的儲備液，用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至濃度分別為1.0，5.0，10.0，20.0，30.0 μmol·L^-1，DMSO最終濃度小于0.1%（DMSO濃度小于0.1%時對細胞活力無影響）。TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP分別用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至相同系列濃度，0.22 μm濾膜過濾除菌，備用。收集對數(shù)期生長的NB4細胞，調(diào)整細胞密度至1×10⁶⁰個/mL，按每孔加100 μL細胞接種于96孔板中。分別設置空白對照組、游離TanⅡ_A組、TanⅡ_A-LP組和CD123-TanⅡ_A-ILP組。各實驗組每孔分別加入20 μL不同濃度的藥物，每組設3個復孔。將96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL MTT溶液（5 g·L^-1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入100 μL十二烷基硫酸鈉（SDS）三聯(lián)溶解液，置于培養(yǎng)箱中過夜，直至生成的甲瓚結(jié)晶完全溶解，于酶標儀上測定波長570 nm（參考波長680 nm）處的吸光度A，計算細胞抑制率和半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）。每組試驗均重復3次。不同制劑在系列TanⅡ_A濃度下的細胞抑制率見圖3。通過SPSS 17.0軟件計算TanⅡ_A，TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP的IC₅₀分別為20.87，11.71，7.17 μmol·L^-1。由結(jié)果可知，與游離TanⅡ_A相比，各濃度下TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP對NB4細胞的抑制率均有明顯提高，其IC₅₀較TanⅡ_A分別降低了1.8，2.9倍（P<0.05）。

2.6 統(tǒng)計學處理

實驗均重復3次，數(shù)據(jù)結(jié)果通過SPSS 17.0軟件回歸分析，數(shù)值以±s表示，組間比較采用One way ANOVA檢驗，P<0.05為具有統(tǒng)計學差異。

3 討論

近年來靶向至CD123陽性表達細胞的免疫治療方法成為研究熱點，如bsscFv[CD123×CD123]和[CD123×CD12]主要通過誘導機體自身的CD16+自然殺傷細胞和CD3+ T細胞對CD123+AML細胞產(chǎn)生細胞免疫效應[17-18]。此外，以CD123介導的嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）修飾T細胞為基礎的腫瘤靶向免疫治療，通過基因修飾獲得可識別CD123受體的T細胞，進而發(fā)展成為提高T細胞靶向殺傷效果的個體化治療方法[19]。然而，目前尚未見CD123 mAb修飾的微粒靶向給藥系統(tǒng)的研究報道。因此，本研究首次嘗試將CD123 mAb修飾于脂質(zhì)體表面制備免疫脂質(zhì)體，以期實現(xiàn)對CD123+AML細胞的主動靶向給藥。由于TanⅡ_A是多藥耐藥蛋白Pgp的底物與抑制劑，Pgp的外排作用和首過效應使其口服利用度極低[20]。CD123 mAb修飾的載TanⅡ_A免疫脂質(zhì)體可通過CD123抗體與其抗原的特異結(jié)合，將載藥脂質(zhì)體選擇性靶向AML細胞，進而通過脂質(zhì)體與胞膜的融合作用，將抗癌藥物導入腫瘤細胞內(nèi)發(fā)揮作用[21]。

本實驗采用薄膜分散―探頭超聲法制備載TanⅡ_A長循環(huán)脂質(zhì)體，其操作較為簡單，適用于載脂溶性藥物脂質(zhì)體的制備。加入的mPEG₂₀₀₀-DSPE可增加脂質(zhì)體的親水性，減少脂質(zhì)體間的聚集而增加其穩(wěn)定性，其可避免RES系統(tǒng)對脂質(zhì)體的吞噬，延長其血循環(huán)時間，從而有利于提高腫瘤靶向效率[22]。將抗體連接到脂質(zhì)體表面的方法有幾種[23]，本研究首先利用抗體上的氨基與SPDP試劑反應，以DTT作為還原劑生成巰基，抗體上的巰基再與Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE上的馬來酰亞胺基團發(fā)生化學交聯(lián)反應生成CD123-PEG₂₀₀₀-DSPE，其DSPE端因具有親脂性，易于插入脂質(zhì)體中而得到免疫脂質(zhì)體，采用后插入法的優(yōu)點在于抗體均連接在脂質(zhì)體的表面，從而增加了抗體密度與可利用性。制備的TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP粒徑均在100 nm左右，免疫脂質(zhì)體的粒徑略有增加，這可能與CD123 mAb修飾有關(guān)。制備的脂質(zhì)體在4 ℃條件下穩(wěn)定性良好，藥物滲漏率低；在37 ℃，pH 7.4 PBS中，粒徑和PDI略有升高，藥物緩慢釋放。流式結(jié)果表明，NB4細胞對CD123-Cou-ILP的攝取顯著增加，有利于提高NB4細胞內(nèi)的藥物濃度。對NB4細胞的藥效學研究結(jié)果表明，CD123-TanⅡ_A-ILP可顯著增強TanⅡ_A對AML細胞的增殖抑制作用，為其后續(xù)的體內(nèi)抑癌研究奠定了實驗基礎。

綜上，CD123-ILP 有望為AML提供新穎的主動靶向給藥載體，也為該類疾病的治療拓展了新的靶向給藥策略。

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[責任編輯 孔晶晶]