張立麗， 金子錚， 劉 寧， 趙艷明， 佟 瑄， 趙 艷， 婁金麗

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 臨檢中心，北京 100069

人體血液中的糖蛋白主要是由肝臟合成，其合成代謝與肝臟的功能密切相關(guān)。在健康狀態(tài)下血液中的糖蛋白上連接的寡糖結(jié)構(gòu)是相當(dāng)穩(wěn)定的，各寡糖的相對含量也是基本固定的，在肝癌發(fā)生時(shí)，肝臟的糖蛋白合成代謝將會(huì)有所改變，表現(xiàn)在寡糖結(jié)構(gòu)和含量上的變化。寡糖鏈檢測(G-Test)試劑盒通過檢測血清中寡糖鏈的含量, 計(jì)算分析出寡糖鏈組分的相對含量(G值)與肝細(xì)胞癌(HCC)的相關(guān)性。本研究對該試劑輔助診斷HBV相關(guān)HCC的臨床性能進(jìn)行評估。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2017年8月-2018年6月就診于本院的310例患者的血清樣本資料。根據(jù)病因分為HBV相關(guān)HCC組(HCC組)、乙型肝炎肝硬化組(肝硬化組)、慢性乙型肝炎組(肝炎組)和其他惡性腫瘤組。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[1]進(jìn)行診斷，其他臟器惡性腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)各腫瘤臨床診斷指南或標(biāo)準(zhǔn)。HBV相關(guān)HCC納入標(biāo)準(zhǔn)為HBsAg必須是陽性，同時(shí)符合下列任何一項(xiàng)即可：(1)病理診斷為HCC，診斷依據(jù)符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)》[2]；(2)臨床診斷為HCC(除病理診斷之外的其他臨床診斷方法可以明確診斷為HCC)。排除標(biāo)準(zhǔn)：丙型肝炎患者血清樣本。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：京佑倫字[2017]0187號(hào))，患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 G-Test試劑盒(熒光毛細(xì)管電泳法，江蘇先思達(dá)生物科技有限公司)，AFP檢測試劑盒(電化學(xué)發(fā)光法，德國羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)。ABI3500Dx基因測序儀(美國Life Technologies公司)，Roche Cobas e601電化學(xué)發(fā)光分析儀(德國羅氏公司)。

1.3 寡糖鏈檢驗(yàn)(G-Test) ABI3500Dx測序儀進(jìn)行毛細(xì)管微電泳分離、測量樣本中寡糖鏈的含量即指紋圖譜(簡稱G-Test 圖譜)，通過計(jì)算分析寡糖鏈組分的相對含量關(guān)系(G值)與HCC的相關(guān)性：(1)G值≥5時(shí)，判定結(jié)果為陽性;(2)G值<5時(shí)，判定結(jié)果為陰性。

1.4 血清AFP檢測 按照Roche Cobas e601電化學(xué)發(fā)光分析儀及配套試劑盒說明書操作檢測各研究對象血清AFP的表達(dá)水平，參考范圍為 <7 ng/ml。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，非正態(tài)計(jì)量資料以M(P25～P75)表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較使用Dunn’s多重比較；計(jì)數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。試劑的靈敏度、特異度、總符合率采用SAS9.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 使用Medcalc 19.0進(jìn)行受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析，ROC曲線下面積(AUC)的比較采用Z檢驗(yàn)。利用logistic回歸建立G-Test與AFP聯(lián)合診斷模型, 使用Graphpad繪制點(diǎn)圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 310例患者中HCC組170例、肝硬化組50例、肝炎組85例、其他惡性腫瘤組5例(結(jié)腸癌1例，膽管惡性腫瘤1例，十二指腸癌1例，喉高分化鱗1例，左肺腺癌1例)。男230例，女80例，年齡22～81歲。HCC組患者G值[6.46(5.73～7.07)]明顯高于肝炎組[3.38(2.85～4.18)]及肝硬化組[3.99(3.13～5.21)](H值分別為107.9、104.2，P值均<0.001)；HCC組患者AFP水平明顯高于肝炎組[0.77(0.45～1.77)log10ng/ml vs 0.58(0.41～0.89)log10ng/ml，H=33.65，P=0.025](圖1)。其他惡性腫瘤組患者只有3例，未進(jìn)行比較。

圖1 各組間G-Test和AFP水平的比較

2.2 G-Test和AFP診斷HCC的各項(xiàng)指標(biāo)

2.2.1 G-Test診斷HCC 將HCC組患者設(shè)為陽性組(n=170)，G-Test陽性142例，陽性符合率即靈敏度為83.53%；肝硬化組、肝炎組和其他惡性腫瘤組3組設(shè)為陰性組(n=140)，G-Test陽性36例，陰性104例，陰性符合率即特異度為74.29%?？傮w符合率為79.36%，陽性預(yù)測值79.78%，陰性預(yù)測值78.79%。

2.2.2 G-Test、不同臨界值A(chǔ)FP及其二者聯(lián)合診斷HCC各項(xiàng)指標(biāo)的比較 310例患者中300例具有AFP檢測結(jié)果，其中HCC 167例，非HCC 133例。血清AFP水平的臨界值分別選取>20、>200、>400 ng/ml。G-Test的靈敏度遠(yuǎn)高于不同臨界值的AFP，但特異度略低于AFP(表1)。

G-Test的AUC明顯高于AFP(0.846 vs 0.611，Z=5.795，P<0.001)(圖2)。使用logistic回歸建立G-Test與AFP聯(lián)合診斷模型：聯(lián)合診斷模型得分=-4.33+0.879×G+0.001×AFP。聯(lián)合診斷模型診斷HCC的AUC為0.870，高于G-Test(Z=2.523，P=0.012)和AFP(Z=6.943，P<0.001)(圖3)。聯(lián)合診斷模型得分的最佳cut-off值為4.53，對應(yīng)的靈敏度為85.03%，特異度為86.47%，約登指數(shù)為0.715，明顯優(yōu)于G-Test和AFP的單獨(dú)診斷效能。

表1 G-Test與AFP診斷HCC性能指標(biāo)的比較

圖2G-test及AFP單項(xiàng)診斷HCC的ROC曲線

圖3 G-Test聯(lián)合AFP診斷模型診斷HCC的ROC曲線

2.2.3 不同分期HCC患者的G-test和AFP檢出率比較 按照《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017版)》[3]對HCC患者進(jìn)行分期，69例可明確分為早期組(Ⅰa期和Ⅰb期，n=26)和中晚期組(n=43)。不管是早期還是中晚期HCC患者，G-Test檢出率均高于AFP檢出率(P值均<0.001)(表2)。

表2 不同分期HCC患者的G-test和AFP檢出率比較[例(%)]

2.2.4 AFP陰性HCC患者中G-Test的檢出率 AFP分別以<20、<200、<400 ng/ml為陰性臨界值分為3組，3組的HCC患者分別為109、135和143例。3組的G-Test(G值≥5)檢出率分別為86.24%(94/109)、85.93%(116/135)、85.31%(122/143)。

3 討論

HCC是目前我國第四位常見惡性腫瘤及第三位腫瘤致死病因[3]。HCC的診斷主要通過B超、CT、MRI[4]等影像學(xué)方法，各種方法各有其特點(diǎn)，需相互補(bǔ)充，全面評判；肝穿刺因其為有創(chuàng)操作，存在出血及針道種植的風(fēng)險(xiǎn)，有時(shí)難以被患者所接受。AFP是唯一被廣泛用于HCC診斷和復(fù)診的血清標(biāo)志物[5-6]。國外通過對肝硬化患者AFP閾值水平(20 ng /ml)的系統(tǒng)綜述評估，發(fā)現(xiàn)在任何HCC階段其敏感度為41%～65%，特異度為41%～94%[7]。一項(xiàng)多中心病例對照研究[8]顯示在早期HCC(BCLC階段0和A)cut-off值較低時(shí)(10.9 ng/ml)，AFP的敏感度和特異度分別高達(dá)66%和82%，但并不能滿足臨床需求。為了改善HCC診斷的準(zhǔn)確性，需要額外的生物標(biāo)志物來輔助AFP。

N-糖組是一種新的有效肝臟疾病血清標(biāo)志物[9]。大多數(shù)的血清N-糖蛋白是由肝臟和B淋巴細(xì)胞合成的，血清中總N-聚糖的變化可能反映了肝臟或B淋巴細(xì)胞的生理改變。G-Test測量的寡糖鏈即N-聚糖，該檢測方法是將傳統(tǒng)生化特異反應(yīng)與高靈敏度的熒光標(biāo)記相結(jié)合，同時(shí)引用毛細(xì)管電泳高分離技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了在普通生化檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室即可以操作的，微量簡便高通量的血液糖蛋白寡糖鏈指紋圖譜分析[9-11]。

本研究中G-Test靈敏度為83.53%，特異度為74.29%，總體符合率為79.36%，陽性預(yù)測值79.78%，陰性預(yù)測值78.79%，診斷性能較好。在300例樣本中，G-Test 的靈敏度(83.83%)遠(yuǎn)高于不同臨界值的AFP(34.73%、19.16%、14.37%)，但特異度(74.44%)略低于AFP(83.46%，96.99%，97.74%)。ROC曲線分析表明，G-Test的AUC明顯高于AFP(Z=5.795，P<0.001)，G-test診斷HCC的效能優(yōu)于AFP。G-Test聯(lián)合AFP診斷模型的最佳cut off值為4.53，對應(yīng)的靈敏度為85.03%，特異度為86.47%，約登指數(shù)為0.715，明顯優(yōu)于G-Test和AFP單項(xiàng)診斷效能。由此說明，G-Test與AFP聯(lián)合檢測可使G-Test的高靈敏度與AFP的高特異度實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢互補(bǔ)，增加了靈敏度與特異度，為臨床輔助診斷HCC提供一個(gè)新的檢測策略。

在慢性肝病進(jìn)展至HCC的過程中，患者血清中N-糖蛋白糖基化修飾均會(huì)發(fā)生異常變化, 不同的腫瘤中也會(huì)有N-聚糖的改變[12-14]，可能降低了G-Test在HCC中的診斷特異度。另有研究[9]顯示在cut-off值為0.34的情況下，應(yīng)用兩個(gè)N-聚糖峰值的比值(命名為GlycoHCCTest)檢測HCC的特異度和敏感度與AFP閾值為100 ng/ml時(shí)非常相似，也有學(xué)者[15]認(rèn)為在病因確定(如HBV或HCV感染)的前提下，應(yīng)用血清N-聚糖標(biāo)志物診斷肝纖維化/肝硬化和HCC效果較好。

Liu等[9]報(bào)道血清N-聚糖的分析是一種新穎的區(qū)分肝硬化和HCC患者的篩查方法，GlycoHCCTest區(qū)分HCC和肝硬化患者的準(zhǔn)確性達(dá)81%±3%。血清AFP在肝硬化患者中檢測HCC的作用是非常有限的[16]。國內(nèi)亦有報(bào)道[17]血清AFP對肝炎、肝硬化的鑒別診斷價(jià)值較低。本研究中，HCC患者G-Test的水平明顯高于肝炎及肝硬化患者(P<0.001)，表明G-Test能較好地區(qū)分HCC與肝炎，肝硬化；HCC患者AFP的水平明顯高于肝炎患者(P<0.05)，但HCC患者與肝硬化患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，是否提示G-Test對于HCC與肝硬化的鑒別診斷性能優(yōu)于AFP，將通過擴(kuò)大臨床樣本量進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究進(jìn)一步比較了G-test和AFP在不同分期HCC中的檢出率，早期和中晚期HCC的G-test(G值≥5)檢出率均高于AFP>400 ng/ml的檢出率， AFP陰性的HCC患者中G-Test的檢出率分別為86.24%、85.93%、85.31%，綜上進(jìn)一步說明G-test對早期HCC的診斷更靈敏，可以作為一個(gè)新的HCC早篩、早診的輔助指標(biāo)，同時(shí)可以彌補(bǔ)AFP靈敏度低的不足，減少HCC的漏診率。

本研究僅評價(jià)了血清N-聚糖對HBV相關(guān)HCC的診斷性能，對于其他病因?qū)е碌穆愿尾。缇凭愿卫w維化/肝硬化等，血清N-聚糖將發(fā)生何種改變，還需要進(jìn)一步研究。那么，G-test是否可通過進(jìn)一步各種病因及干擾因素的大量臨床實(shí)驗(yàn)研究，重新界定G-Test的閾值，以提高其特異性，是筆者進(jìn)一步研究的方向。