林 玲，劉芷君，雷鄭延，曾文治，程福建，林全女，楊江帆*

1福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院；2茶學(xué)福建省高校重點實驗室，福州350002

高脂血癥通常指血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)和(或)總甘油三酯(triglycerides，TG)水平升高，是“三高”之一，致使不利于機體健康的相關(guān)物質(zhì)大量積累，導(dǎo)致肝臟負擔(dān)過重、血管血栓沉淀等，引發(fā)動脈粥樣硬化、糖尿病等多種并發(fā)癥[1,2]。2010年～2030年，我國心血管患者人數(shù)將因血清膽固醇水平的升高約增加920萬，高膽固醇血癥患者也日趨低齡化[3]。

近年來，隨著“人類微生物組計劃”、“腸道元基因組計劃”等研究項目的開展，人類對腸道菌群的關(guān)注達到了空前的高度。腸道微生物群體與宿主、外界環(huán)境建立起一個動態(tài)的生態(tài)平衡，對維持人體健康起著重要的作用[4]。2016年《PNAS》報道，高脂飲食小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)顯著不同于正常小鼠[5]，而高脂飲食是高脂血癥的最主要誘因。腸道菌群在高脂血癥的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要的角色，使腸道菌群成為調(diào)節(jié)脂代謝異常的研究熱點和新方向。目前有關(guān)茶籽皂苷對腸道菌群影響的報道寥寥無幾，有關(guān)高脂血癥腸道菌群影響的研究更是匱乏。而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，茶籽皂苷能調(diào)節(jié)高脂飼料致大鼠高脂血癥模型的血脂水平，減輕肝臟脂肪變性程度，同時還能改善高脂血癥帶來的氧化損傷和肝臟損傷，提高機體的抗氧化能力[6]。因此本文選用茶籽皂苷進行動物實驗，通過16S rRNA測序技術(shù)的檢測，進一步研究茶籽皂苷對高脂血癥大鼠腸道菌群的影響，以期為茶籽皂苷調(diào)節(jié)血脂機理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶籽皂苷(含量：71.21%，批號：180314001，湖南漢清生物技術(shù)有限公司)；羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na，上海源葉生物科技有限公司)；辛伐他汀片(批號：H20093421，湖北廣濟藥業(yè)股份有限公司)；無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級雄性Wistar大鼠60只(體重：200±20g，生產(chǎn)許可證號：SCXK (滬)2012-0002，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司)；對硝基苯酚、水合氯醛(分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司)；高脂飼料(輻照，北京博愛科貿(mào)有限公司，配方：蛋黃粉10%、豬油5%、膽固醇5%、膽鹽 0.5%、丙硫氧嘧啶0.2%、基礎(chǔ)飼料79.3%)；普通飼料(福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心)；TransStart Fastpfu DNA Polymerase(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(美國AXYGEN公司)。

KDC-2046低速冷凍離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；TE601-L電子天平(德國賽多利斯公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立與分組

本實驗在福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級屏障動物實驗室進行。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22～26 ℃，相對濕度40%～70%，明暗交替條件為12 h/12 h。大鼠均在同一環(huán)境下隨機分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲水?dāng)z食。

60只雄性Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為10只正常組和50只造模組，分別飼喂基礎(chǔ)飼料、高脂飼料。4周后禁食12 h斷尾取血，檢測TC與正常組有顯著差異(P<0.05)，則造模成功[7]。如表1，將造模組按體重隨機分為模型對照組、陽性對照組和茶籽皂苷低、中、高劑量組，每日上午定時連續(xù)灌胃給藥四周，末次給藥后24 h(禁食不禁水12 h)，處死，收集大鼠盲腸的腸道內(nèi)容物保存待測。所用灌胃藥物均使用0.5% CMC-Na作為溶劑進行配制。

表1 動物分組與給藥方法

1.2.2 腸道內(nèi)容物DNA的提取和高通量測序

采用DNA 提取試劑盒抽提大鼠盲腸內(nèi)容物DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。

將DNA樣品在冰上融化后，離心并充分混勻，Nanodrop 2000檢測樣品質(zhì)量，取30 ng按16S rRNA V3-V4測序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物，進行PCR擴增。引物序列：515a(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)；反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；50 ℃ 30 s；72 ℃ 60 s；72 ℃ 7 min；4 ℃ end，30個循環(huán)。使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。Miseq文庫構(gòu)建(北京奧維森基因科技有限公司)，并使用HiSeq2500 PE250 測序平臺進行上機測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)下機后，結(jié)果以Fastq格式存儲。Miseq測序得到的是Pair-End(PE)雙端序列數(shù)據(jù)，對測得的Fastq數(shù)據(jù)進行質(zhì)控處理，最終得到優(yōu)質(zhì)的Fasta數(shù)據(jù)：下機數(shù)據(jù)在去除barcode和primer并拼接后，經(jīng)進一步去除嵌合體、短序列后得到優(yōu)質(zhì)序列。用uparse聚類法生成OTUs(對97%相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析)，進一步采用RDP Classifier算法對OTU代表序列進行比對分析(數(shù)據(jù)庫：silva(release128/132 http://www.arb-silva.de))，并在門(phylum)、科(family)、屬(genus)三個水平注釋其群落的物種信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型建立

造模4周后，造模組血清TC(2.10±0.09 mmol/L)顯著高于正常組(1.36±0.03 mmol/L)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明高脂血癥模型已成功建立[7]。

2.2 高通量測序基本數(shù)據(jù)分析

高通量測序處理后獲得3 387 619條優(yōu)質(zhì)序列數(shù)，其中樣本最大序列數(shù)為136 867條，最小序列數(shù)為28 656 條，每個樣本的平均序列數(shù)為65 959.94 條，99.87%的序列長度分布在200～260 bp區(qū)間。由圖1的稀釋曲線可知，各組OTU 數(shù)量與測序數(shù)量正相關(guān)，且曲線隨著測序量增多逐漸趨向平坦，說明測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中的所有物種。

圖1 大鼠腸道菌群的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of rat intestinal microflora

花瓣圖是一種表示樣本/組間特有和共有OTU數(shù)目的展示方式，以每個花瓣代表一個樣品，中間的core數(shù)字代表的是所有樣品共有的OTU數(shù)目，花瓣上的數(shù)字代表該樣品特有的OTU數(shù)目。聚類結(jié)果分析可知(如圖2)，六組大鼠共同擁有358個OTUs，各組也存在其特有的OTUs。

2.3 茶籽皂苷對高脂血癥大鼠腸道菌群物種的豐度和多樣性的影響

測定物種(observed species)指數(shù)表示該樣品中含有的物種數(shù)目，數(shù)值越高表明樣品豐度越高；香農(nóng)(shannon)指數(shù)是用來估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一，shannon值越大，說明群落多樣性越高。如圖3所示，與C相比，H組大鼠的observed species指數(shù)顯著降低(P<0.05)，而茶籽皂苷各劑量組的豐度均低于C組但略高于H組，P組與H組相仿，表明高脂飲食可導(dǎo)致大鼠腸道菌群豐度顯著降低，而茶籽皂苷可提升大鼠腸道菌群豐度。與C相比，H組大鼠的shannon指數(shù)極顯著降低(P<0.01)，P組與H組相仿，而茶籽皂苷各劑量組的多樣性均低于H 組，表明高脂飲食可導(dǎo)致大鼠腸道菌群多樣性極顯著降低，但茶籽皂苷并不能抑制這種趨勢，甚至加劇了趨勢，這可能與茶籽皂苷的殺菌消炎功效相關(guān)，可能是其減少了一些菌群物種，但同時增加了某些菌群物種的數(shù)量，導(dǎo)致其豐度上升，多樣性下降。但有趣的是，隨著茶籽皂苷劑量的提高，大鼠腸道菌群的多樣性有所提高，這其中的原理需要做進一步的研究探討。

圖2 大鼠腸道菌群的OTU分布花瓣圖Fig.2 OTU distribution petal map of rat intestinal microflora注：花瓣圖以每個花瓣代表一個樣品，中間的core數(shù)字代表的是所有樣品共有的OTU數(shù)目，花瓣上的數(shù)字代表該樣品特有的OTU數(shù)目。Note:In the petal chart,each petal represents a sample,the core number in the middle represents the number of OTUs common to all samples,and the number on the petal represents the number of OTUs unique to the sample.

圖3 茶籽皂苷對大鼠腸道菌群observed species指數(shù)和shannon指數(shù)的影響Fig.3 Effects of tea seed saponin on intestinal microflora observed species index and shannon index in rats

2.4 茶籽皂苷對高脂血癥大鼠腸道菌群群落結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 茶籽皂苷對門水平上高脂血癥大鼠腸道菌群分布的影響

圖4顯示，在門水平上，六組大鼠的腸道菌群主要被劃分為:厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetae)、放線菌門(Actinobacteria)等。其中Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria 這三個細菌門類的占絕對優(yōu)勢，占到了測序序列總數(shù)的85%以上。高脂飲食使大鼠腸道內(nèi)的Firmicutes 與Actinobacteria的相對豐度極顯著降低(P<0.01)，Proteobacteria和Spirochaetae的相對豐度極顯著升高(P<0.01)，Bacteroidetes的相對豐度顯著升高(P<0.05)，這與Tomas、Wang等[5，8-16]的研究成果一致，而高脂飲食的同時攝入辛伐他汀和不同劑量茶籽皂苷對這一趨勢均具有不同程度地調(diào)節(jié)效果。相對于H組，不同劑量茶籽皂苷均可極顯著提高Firmicutes的相對豐度(P<0.01)，P組有所提高，但無統(tǒng)計學(xué)意義；TSH組Actinobacteria 的相對豐度極顯著提高(P<0.01)，TSM組顯著提高(P<0.05)，TSL組和P組基本無變化；TSM組和TSH組Proteobacteria的相對豐度顯著降低(P<0.05)，而TSL組和P組Proteobacteria的相對豐度反而有所提高；辛伐他汀和不同劑量茶籽皂苷均可極顯著降低Spirochaetae的相對豐度(P<0.01)；P組和TSH組Bacteroidetes的相對豐度極顯著降低(P<0.01)，TSL組和TSM組顯著降低(P<0.05)。上述結(jié)果表明，茶籽皂苷對由高脂飼料誘發(fā)的高脂血癥大鼠的腸道菌群門水平上菌群結(jié)構(gòu)具有較好的調(diào)節(jié)作用，且呈量效關(guān)系，茶籽皂苷高劑量組的調(diào)節(jié)效果最佳。但目前更多的研究傾向于研究腸道菌群的低分類水平菌群結(jié)構(gòu)。

2.4.2 茶籽皂苷對科水平上高脂血癥大鼠腸道菌群分布的影響

如圖5所示，在科水平上，高脂飲食使毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)的相對豐度極顯著降低(P<0.01)，脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、紫單孢菌科(Porphyromonadaceae)的相對豐度極顯著升高(P<0.01)，這與Collins和Daniel等[17-21]的研究結(jié)果一致。Lachnospiraceae和Ruminococcaceae均屬于梭菌目(Clostridiales)、厚壁菌門，與肥胖呈負相關(guān)；Desulfovibrionaceae 屬于脫硫弧菌目(Desulfovibrionales)、變形菌門，會產(chǎn)生內(nèi)毒素；Porphyromonadaceae屬于擬桿菌目(Bacteroidales)、擬桿菌門，與體重存在正相關(guān)[20-22]。與H組相比，P組和TSH組Lachnospiraceae的相對豐度顯著提高(P<0.05)，TSL組和TSM組有所提高，但無統(tǒng)計學(xué)意義；TSL組和TSH組Ruminococcaceae 的相對豐度極顯著提高(P<0.01)，P組和TSM組有所提高，但無統(tǒng)計學(xué)意義；TSM組、TSH組和P組Desulfovibrionaceae的相對豐度極顯著降低(P<0.01)，TSL組并未抑制其升高的趨勢；P組和TSH組Porphyromonadaceae的相對豐度極顯著降低(P<0.01)，TSL組和TSM組有所下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義。研究表明，茶籽皂苷對高脂血癥大鼠的腸道菌群科水平上菌群結(jié)構(gòu)具有較好的調(diào)節(jié)作用，其中對Lachnospiraceae、Desulfovibrionaceae和Porphyromonadaceae調(diào)節(jié)作用且呈量效關(guān)系，茶籽皂苷高劑量組的效果最佳。

圖4 茶籽皂苷對門水平上大鼠腸道菌群分布的影響Fig.4 Effects of tea seed saponin on relative abundance of intestinal microflora in rats at phylum level

圖5 茶籽皂苷對科水平上大鼠腸道菌群分布的影響Fig.5 Effects of tea seed saponin on relative abundance of intestinal microflora in rats at family level

2.4.3 茶籽皂苷對屬水平上高脂血癥大鼠腸道菌群分布的影響

如圖6所示，在屬水平上，H組大鼠的腸道菌群中屬于硫酸鹽還原菌類的脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)相對豐度極顯著高于C 組(P<0.01)，這與Liu等[23]的研究一致。研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥患者體內(nèi)長期存在代謝性炎癥，而硫酸鹽還原菌的代謝產(chǎn)物會破壞腸道屏障，誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生[24]。而灌胃辛伐他汀和不同劑量茶籽皂苷的高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥大鼠腸道內(nèi)Desulfovibrio相對豐度得以控制，均極顯著下降(P<0.01)。

高脂飲食使羅斯氏菌屬(Roseburia)極顯著下降(P<0.01)，而Roseburia有益于治療和預(yù)防肥胖相關(guān)疾病[25]。與H組相比，P組和TSH組Roseburia的相對豐度極顯著提高(P<0.01)，TSM組顯著提高(P<0.05)，TSL組也有所提高，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

相較于C組，H組大鼠的糞桿菌真核菌屬(Eubacterium_coprostanoligenes_group)極顯著降低(P<0.01)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Eubacterium_coprostanoligenes_group是降低膽固醇的微生物，與體重、TG呈負相關(guān)[26]。與H組相比，TSH組Eubacterium_coprostanoligenes_group的相對豐度極顯著提高(P<0.01)，恢復(fù)到C組相近水平， TSM組和P組也有所提高，但無統(tǒng)計學(xué)意義，TSL組沒有改善效果。

圖6 茶籽皂苷對屬水平上大鼠腸道菌群分布的影響Fig.6 Effects of tea seed saponin on relative abundance of intestinal microflora in rats at genus level

實驗中，H組大鼠乳桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度低于C 組，與Xiong等[27]的研究一致。而灌胃中劑量和高劑量茶籽皂苷后的TSM組和TSH組高脂血癥大鼠腸道內(nèi)Lactobacillus相對豐度得以極顯著提高(P<0.01)，TSL組也有所提高，但無統(tǒng)計學(xué)意義，P組沒有改善效果，甚至比H組更低。Lactobacillus具有降膽固醇的效果，作用于血清TC、TG、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)[28]。

瘤胃球菌屬與代謝紊亂存在關(guān)聯(lián)，其在高脂膳食宿主腸道內(nèi)的相對豐度較低[29]。研究中，H組大鼠瘤胃球菌科_NK4A214_group(Ruminococcaceae_NK4A214_group)和瘤胃球菌科_UCG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)的豐度比C組極顯著降低(P<0.01)，與H組相比，TSH組Ruminococcaceae_NK4A214_group和Ruminococcaceae_UCG-014的相對豐度極顯著提高(P<0.01)；TSM組和P組Ruminococcaceae_NK4A214_group的相對豐度顯著提高(P<0.05)，Ruminococcaceae_UCG-014的相對豐度也有所提高，但無統(tǒng)計學(xué)意義；TSL組Ruminococcaceae_NK4A214_group也有所提高，但無統(tǒng)計學(xué)意義，Ruminococcaceae_UCG-014沒有改善效果。

上述結(jié)果表明，茶籽皂苷對高脂膳食引起的屬水平上的腸道菌群失衡具有一定的調(diào)節(jié)作用，且呈量效關(guān)系，茶籽皂苷高劑量組的調(diào)節(jié)效果最佳。

2.5 茶籽皂苷對高脂血癥大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)差異性的影響

將屬水平豐度排名在前二十的菌群根據(jù)物種注釋及豐度信息進行相似性聚類，表示在熱圖上，通過顏色梯度及相似程度來反映各組大鼠屬水平上腸道菌群群落組成的相似性和差異性。從圖7可以看出，H組和C組大鼠屬水平上的腸道菌群之間存在結(jié)構(gòu)差異性，P組、茶籽皂苷各劑量組與H組之間也具有結(jié)構(gòu)差異性。在六組大鼠中，TSH組與C組相對接近，表明茶籽皂苷能改善高脂血癥大鼠腸道的菌群結(jié)構(gòu)，其中以茶籽皂苷高劑量的改善效果為好。

從圖8可以看出，其很明顯地分成了六個小組，其中C組和H組存在顯著差異，說明高脂飲食引起了大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化。藥物治療后，P組、TSH組與H組距離較遠，TSL組、TSM組與H組相近。

圖7 大鼠腸道菌群的熱圖和聚類樹Fig.7 Heatmap and clustering tree of rat intestinal microflora

圖8 大鼠腸道菌群的PCA分析Fig.8 PCA analysis of rat intestinal microflora

3 小結(jié)

本研究采用16S rRNA測序技術(shù)探討了茶籽皂苷對由高脂飼料誘發(fā)的高脂血癥大鼠的盲腸菌群α-多樣性以及門、科、屬分類水平組成的影響。高脂飲食及高脂血癥可因造成腸道內(nèi)養(yǎng)料來源減少、改變氧化還原狀態(tài)、破壞菌群賴以生存的微環(huán)境來影響腸道菌群的構(gòu)成[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)高脂血癥大鼠腸道菌群豐度和多樣性顯著降低；門水平上，F(xiàn)irmicutes 與Actinobacteria 的相對豐度極顯著降低，Proteobacteria、Spirochaetae和Bacteroidetes顯著升高；科水平上，Lachnospiraceae、Ruminococcaceae極顯著降低，Desulfovibrionaceae、Porphyromonadaceae極顯著升高；屬水平上，Desulfovibrio極顯著升高，Roseburia、Eubacterium_coprostanoligenes_group、Ruminococcaceae_NK4A214_group和Ruminococcaceae_UCG-014極顯著下降，Lactobacillus相對豐度低于C 組。同時，本試驗還發(fā)現(xiàn)高脂血癥的發(fā)生會引起腸道菌群結(jié)構(gòu)性失調(diào)。以上證明了高脂血癥的發(fā)生影響了腸道菌群的結(jié)構(gòu)和相對豐度，而腸道菌群在高脂血癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。

經(jīng)過茶籽皂苷的調(diào)節(jié)，高脂血癥大鼠腸道菌群的豐度得到提升，但多樣性未得到改善。門水平上，TSH組Firmicutes和Actinobacteria的相對豐度極顯著提高，Proteobacteria、Spirochaetae和Bacteroidetes顯著降低；TSM組Firmicutes和Actinobacteria顯著提高，Proteobacteria、Bacteroidetes和Spirochaetae顯著降低；TSL組Firmicutes極顯著提高，Spirochaetae和Bacteroidetes顯著降低，Actinobacteria和Proteobacteria無顯著性改變?？扑缴希琓SH組Lachnospiraceae和Ruminococcaceae 顯著提高，Desulfovibrionaceae和Desulfovibrionaceae極顯著降低；TSM組Lachnospiraceae、Ruminococcaceae和Porphyromonadaceae有所調(diào)節(jié)，但無統(tǒng)計學(xué)意義，Desulfovibrionaceae極顯著降低；TSL組Lachnospiraceae和Porphyromonadaceae有所調(diào)節(jié)，但無統(tǒng)計學(xué)意義，Ruminococcaceae極顯著提高，Desulfovibrionaceae升高的趨勢未被抑制。屬水平上，TSH組Desulfovibrio極顯著下降，Roseburia、Eubacterium_coprostanoligenes_group、Ruminococcaceae_NK4A214_group和Ruminococcaceae_UCG-014極顯著提高；TSM組Desulfovibrio極顯著下降(P<0.01)，Roseburia、Ruminococcaceae_NK4A214_group和Lactobacillus顯著提高，Eubacterium_coprostanoligenes_group和Ruminococcaceae_UCG-014也有所提高，但無統(tǒng)計學(xué)意義；TSL組Desulfovibrio極顯著下降，Roseburia和Ruminococcaceae_NK4A214_group也有所提高，但無統(tǒng)計學(xué)意義，Eubacterium_coprostanoligenes_group和Ruminococcaceae_UCG-014沒有改善。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)茶籽皂苷對由高脂飼料誘發(fā)的高脂血癥大鼠的腸道菌群起到正向調(diào)節(jié)作用。而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，茶籽皂苷能調(diào)節(jié)喂食高脂飼料致大鼠高脂血癥模型的血脂水平，減輕肝臟脂肪變性程度，同時還能改善高脂血癥帶來的氧化損傷和肝臟損傷，提高機體的抗氧化能力[6]。因而，推測茶籽皂苷調(diào)解血脂的作用機制之一是通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)進而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝來實現(xiàn)的。