牟洪燕 黃 瑾 李維英 樊慧明 詹懷宇

（1.華南理工大學(xué)制漿造紙工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州，510640；2.華南理工大學(xué)輕工與食品實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，廣東廣州，510640；3.新益昌自動化設(shè)備有限公司，廣東深圳，518103）

木質(zhì)素對纖維素酶的吸附主要是通過疏水作用、靜電作用和氫鍵作用來實(shí)現(xiàn)的。木質(zhì)素對纖維素酶的吸附親和力與木質(zhì)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，如酚羥基、羧酸基等官能團(tuán)[1]。酚羥基含量與木質(zhì)素對纖維素酶的吸附能力成正比[2]。改變pH值會顯著改變纖維素酶的表面電荷，使木質(zhì)素與纖維素酶的吸附親和力發(fā)生變化[3]。有研究者提出通過pH誘導(dǎo)木質(zhì)素表面修飾，以減少其與非特異性纖維素酶的結(jié)合，從而促進(jìn)木質(zhì)纖維素的酶水解[4]?；谀举|(zhì)素的化學(xué)性質(zhì)和其對纖維素酶的吸附能力，木質(zhì)素-纖維素酶復(fù)合物具有固定纖維素酶的潛在功能[5-6]。姚蘭等人[7]對比研究了不同木質(zhì)素對纖維素酶的吸附作用。劉祖廣等人[8]通過苯酚改性硫酸鹽木質(zhì)素得到酚化木質(zhì)素，并對比研究了改性前后木質(zhì)素的性能差異。由于酚化木質(zhì)素含有更多的酚羥基和游離反應(yīng)位點(diǎn)[9],因此采取酚化改性來提高木質(zhì)素的反應(yīng)活性。本研究以間苯二酚和連苯三酚為酚化試劑，分別對桉堿木質(zhì)素進(jìn)行了酚化改性以增加酚羥基的含量，比較了不同側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的酚化木質(zhì)素對纖維素酶吸附的影響。綜合分析比較了不同酚化木質(zhì)素對纖維素酶吸附作用的差異，并對酚化木質(zhì)素的物化性質(zhì)進(jìn)行了表征。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

桉木片取自博匯制漿廠；間苯二酚、連苯三酚、氫氧化鈉、硫酸、乙酸、乙酸鈉、丙酮等試劑均取自Sigma-Aldrich公司；賽力二代纖維素酶（Cellic CTec2）取自Novozymes公司。以上所有試劑均為分析純，無需進(jìn)一步純化可直接使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

紫外可見分光光度計(jì)（UV-1900，美國）；掃描電子顯微鏡（SEM，EVO18，德國）；凝膠滲透色譜儀（GPC，Agilent 1200，美國）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（REE-52AA，上海）；氣浴恒溫振蕩器（THZ-C，金壇成輝儀器）等。

1.3 木質(zhì)素酚化改性

按照文獻(xiàn)[10]從黑液中提取桉堿木質(zhì)素并用濃硫酸純化，稱取2 g純化后的桉堿木質(zhì)素粉末，加入20 g的間苯二酚（或連苯三酚）混合均勻，再加入15 mL丙酮使其溶解。然后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去丙酮，在室溫下加入40 g 的72%濃硫酸，攪拌反應(yīng)1 h。反應(yīng)后過濾，并用大量蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，干燥后研磨得到木質(zhì)素間苯二酚（或木質(zhì)素連苯三酚）。

1.4 酚化木質(zhì)素乙酰化

分別稱取1 g 上述制備的木質(zhì)素間苯二酚（或木質(zhì)素連苯三酚）與10 mL 乙?；噭ㄒ阴Ｂ扰c冰醋酸體積比為1∶4），充分混合均勻，在40℃的密閉環(huán)境下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后于50℃條件下水浴至溶劑揮發(fā)，再加入少量蒸餾水超聲清洗5 min，過濾，反復(fù)沖洗3～4次，于50℃烘箱低溫干燥，研磨得到乙?；?或乙酰化三酚)[11]。

1.5 木質(zhì)素對纖維素酶的吸附

準(zhǔn)確稱取50 mg酚化木質(zhì)素，依次加入2 mL纖維素酶液和18 mL pH 值為4.8 的乙酸-乙酸鈉緩沖液，超聲5 min 使其混合均勻。將盛有上述樣品的離心管置于50℃、180 r/min 的氣浴恒溫振蕩器，分別于1、3、6、12、24 h 取樣，在轉(zhuǎn)速為5000 r/min 下離心10 min，分離得到的沉淀物于35℃烘箱低溫干燥。上清液用0.45 μm 濾膜過濾，以考馬斯亮藍(lán)為顯色劑，在595 nm 處測定紫外吸光度值，根據(jù)繪制的“吸光度(y)-蛋白質(zhì)濃度(x，g/L)”曲線方程（y=12.523x+0.0567，R2=0.9994）計(jì)算纖維素酶蛋白含量[12]，用不加纖維素酶的溶液作為空白組。采用相同的方法測乙?；男缘姆踊举|(zhì)素對纖維素酶的吸附量。吸附量（mg/g）及吸附率（%）計(jì)算分別見式（1）和式（2）。

1.6 纖維素酶的脫附及再吸附

移取1.5 中吸附反應(yīng)3 h 離心后干燥的沉淀物，加入pH 值10 的乙酸-乙酸鈉緩沖液，超聲混合均勻，于50℃、180 r/min 的氣浴恒溫振蕩器反應(yīng)3 h，離心后測上清液中酶蛋白含量[12]。采用1.5 中相同步驟測沉淀物對纖維素酶的重復(fù)吸附率。脫附率（%）及重復(fù)吸附率（%）計(jì)算分別見式（3）和式（4）。

1.7 被吸附纖維素酶的濾紙酶活

選取1.5 中吸附3 h 時離心后干燥的沉淀物，依次向離心管中加入50 mg 定性濾紙條和1.5 mL pH 值4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液，于50℃、180 r/min的氣浴恒溫振蕩器中振蕩30 min。離心后上清液用0.25 μL濾膜過濾，用3,5-二硝基水楊酸(DNS)作為顯色劑，在540 nm 處測定紫外吸光度值。根據(jù)繪制的“吸光度(y)-葡萄糖濃度(x，g/L)”曲線方程：y=2.9011x-0.1487，R2=0.9993，計(jì)算濾紙酶活[13]，并根據(jù)式（5）計(jì)算吸附酶活保留率（%）。

1.8 SEM分析

采用掃描電子顯微鏡對木質(zhì)素微觀形貌進(jìn)行表征。

1.9 物化性質(zhì)表征

1.9.1 相對分子質(zhì)量的測定

采用配備Shodex KF-803L柱的凝膠滲透色譜儀測定酚化木質(zhì)素相對分子質(zhì)量。流動相四氫呋喃作為洗脫液，流速為1.0 mL/min，注射體積為100 μL。

1.9.2 表面電荷的測定

根據(jù)文獻(xiàn)[14]測定不同酚化木質(zhì)素的表面電荷。

1.9.3 酚羥基含量測定

酚羥基含量=總酸基團(tuán)含量-羧基含量[15]

總酸基團(tuán)含量的測定：稱取約40～60 mg 酚化木質(zhì)素m1，加入5 mL 0.1 mol/L NaOH 和2 mL 乙醇，85℃下水浴30 min。水浴結(jié)束后立刻加入1 mL 10%BaCl2，冷卻后定容至25 mL，離心取15 mL 上清液于預(yù)先盛有5 mL 0.1 mol/L HCl 的錐形瓶中，加入5 滴甲基紅-亞甲基藍(lán)混合指示劑，用0.01 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，記錄滴定前后的體積差V1。總酸基團(tuán)含量（mol/g）計(jì)算見式（6）。

羧基含量的測定：稱取40～60 mg酚化木質(zhì)素m2，加入20 mL 0.2 mol/L 醋酸鈣溶液，85℃下水浴30 min，定容至25 mL。過濾，取20 mL 濾液于錐形瓶中，加入5 滴甲酚紅-百里酚藍(lán)混合指示劑，用0.01 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，記錄滴定前后的體積差V2。羧基含量（mol/g）計(jì)算見式（7）。

2 結(jié)果與討論

2.1 木質(zhì)素對纖維素酶的吸附

本研究探討了不同側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的酚化木質(zhì)素對纖維素酶的吸附作用效果以及酚羥基含量與木質(zhì)素對纖維素酶吸附影響的關(guān)系，結(jié)果見圖1。從圖1 可以看出，纖維素酶的吸附在24 h 達(dá)到平衡，木質(zhì)素間苯二酚和木質(zhì)素連苯三酚的最大吸附量分別為842.1 mg/g 和911.4 mg/g。已知文獻(xiàn)報道木質(zhì)素的酚羥基含量與木質(zhì)素對纖維素酶的吸附能力具有正相關(guān)性[2]。從圖1 可以看出，木質(zhì)素連苯三酚對纖維素酶的吸附能力強(qiáng)于木質(zhì)素間苯二酚，這可能是由于木質(zhì)素不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)造成的，因?yàn)槔碚撋显谙嗤姆踊磻?yīng)條件下，木質(zhì)素連苯三酚的酚羥基含量高于木質(zhì)素間苯二酚。從圖1中還可以看出，與酚化木質(zhì)素相比，乙?；蟮姆踊举|(zhì)素對纖維素酶的吸附能力大幅降低。主要是因?yàn)橐阴；軌蛉コ蟛糠值姆恿u基，從而導(dǎo)致乙?；男缘姆踊举|(zhì)素對纖維素酶的吸附作用顯著降低。從而進(jìn)一步證明了酚羥基含量的變化影響木質(zhì)素對纖維素酶的吸附作用。

圖1 木質(zhì)素對纖維素酶的吸附能力

2.2 纖維素酶的脫附及再吸附

圖1中所示在3 h前木質(zhì)素間苯二酚和木質(zhì)素連苯三酚對纖維素酶的吸附速率最快，3 h時其吸附量分別從194.9 mg/g 和259.6 mg/g 提 高 到369.6 mg/g 和513.5 mg/g。因此，選取3 h時吸附纖維素酶的酚化木質(zhì)素作進(jìn)一步研究。將吸附纖維素酶的酚化木質(zhì)素分散在pH值為10的緩沖液中，被吸附的纖維素酶發(fā)生脫附行為。Saini等人[3]研究表明調(diào)節(jié)pH值有利于被吸附纖維素酶的分離，這主要是因?yàn)楫?dāng)pH值升高時可以顯著改變木質(zhì)素的表面電荷，帶負(fù)電荷的纖維素酶和木質(zhì)素之間的斥力增強(qiáng)，從而減少了纖維素酶的非生產(chǎn)性結(jié)合。改變pH值可以促進(jìn)被吸附纖維素酶與木質(zhì)素表面的分離，因此是一種經(jīng)濟(jì)可行的促進(jìn)纖維素酶回收利用的方法。

圖2 酚化木質(zhì)素對纖維素酶的脫附與再吸附

圖3 桉堿木質(zhì)素及酚化木質(zhì)素的SEM圖

纖維素酶的脫附率以及被吸附纖維素酶的酶活保留率如圖2 所示。從圖2 可以看出，木質(zhì)素間苯二酚和木質(zhì)素連苯三酚對纖維素酶的脫附率分別為57.3%和30.2%，其重復(fù)吸附率分別為第一次吸附能力的72.3%和26.9%。與初始酶活相比，被木質(zhì)素間苯二酚和連苯三酚吸附的纖維素酶的酶活保留率分別為57%和38%。結(jié)果表明，更少的纖維素酶從木質(zhì)素連苯三酚中釋放，是因?yàn)槟举|(zhì)素連苯三酚中含有更多的酚羥基使負(fù)電荷增加，導(dǎo)致被吸附的纖維素酶因較強(qiáng)的靜電力而增加，從而使吸附的纖維素酶難以釋放。且與木質(zhì)素連苯三酚相比，木質(zhì)素間苯二酚對纖維素酶的酶活影響相對較小。

2.3 SEM表征

圖3 為桉堿木質(zhì)素及酚化木質(zhì)素的SEM 圖。從圖3 可以看出，酚化木質(zhì)素表面形態(tài)有較大的變化。桉堿木質(zhì)素并未表現(xiàn)出微球結(jié)構(gòu)，而木質(zhì)素間苯二酚和木質(zhì)素連苯三酚均有微球結(jié)構(gòu)，且木質(zhì)素連苯三酚的微球粒徑比木質(zhì)素間苯二酚的小。從圖3（b）和圖3（c）均可觀察到顆粒的表面布滿了微孔，微孔孔徑小而密。木質(zhì)素分子主要表現(xiàn)為細(xì)小的顆粒，而且顆粒表面存在一些小孔，這為其物理性吸附提供了可能。

2.4 木質(zhì)素的物化性質(zhì)

為進(jìn)一步解釋木質(zhì)素間苯二酚和木質(zhì)素連苯三酚對纖維素酶吸附作用的差異，本研究分別對兩種酚化木質(zhì)素進(jìn)行了物理化學(xué)性質(zhì)分析表征。

采用凝膠滲透色譜法對桉堿木質(zhì)素及酚化木質(zhì)素的相對分子質(zhì)量分布進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖4 所示。從圖4可以看出，木質(zhì)素連苯三酚的數(shù)均相對分子質(zhì)量（Mn）和質(zhì)均相對分子質(zhì)量（Mw）均略高于木質(zhì)素間苯二酚，說明木質(zhì)素連苯三酚解聚較為嚴(yán)重。木質(zhì)素間苯二酚和連苯三酚的相對分子質(zhì)量分散指數(shù)（PD=Mn/Mw）值均低于桉堿木質(zhì)素。結(jié)果表明，木質(zhì)素的PD 值與纖維素酶吸附能力成反比[16]。木質(zhì)素的PD 值越低，相對分子質(zhì)量越大，對纖維素酶的吸附親和力越高。因此，相對分子質(zhì)量和PD 值是導(dǎo)致兩種酚化木質(zhì)素對纖維素酶吸附能力不同的原因之一。

圖4 木質(zhì)素的相對分子質(zhì)量及其分布

本研究測定了酚化木質(zhì)素表面電荷、羧基含量和酚羥基的含量，結(jié)果見表1。從表1 可以看出，桉堿木質(zhì)素、木質(zhì)素間苯二酚和木質(zhì)素連苯三酚的表面電荷分別為-0.83、-1.27、-0.41 mmol/g，木質(zhì)素間苯二酚表面負(fù)電荷高于木質(zhì)素連苯三酚。結(jié)合圖1可知木質(zhì)素間苯二酚對纖維素酶的吸附能力較低。原因是因?yàn)榉踊举|(zhì)素表面負(fù)電荷越大，與纖維素酶的靜電斥力越強(qiáng)，從而導(dǎo)致對纖維素酶的吸附親和力降低[17]。與木質(zhì)素間苯二酚相比，木質(zhì)素連苯三酚的酚羥基含量更多，吸附能力更強(qiáng)，說明酚羥基含量越高，木質(zhì)素與纖維素酶吸附親和力越強(qiáng)。結(jié)合對纖維素酶吸附結(jié)果，通過物理化學(xué)檢測可知，酚化木質(zhì)素的相對分子質(zhì)量、表面電荷和酚羥基含量對纖維素酶的吸附作用效果均有影響，且酚羥基含量在木質(zhì)素對纖維素酶的吸附中起著極其重要的作用。

表1 木質(zhì)素的物理化學(xué)性質(zhì)

3 結(jié) 論

本研究以間苯二酚和連苯三酚為酚化試劑，分別對桉堿木質(zhì)素進(jìn)行了酚化改性以增加酚羥基的含量，比較了不同側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的酚化木質(zhì)素對纖維素酶吸附的影響。

3.1 酚化改性后，木質(zhì)素間苯二酚和木質(zhì)素連苯三酚對纖維素酶的吸附能力均高于桉堿木質(zhì)素，對纖維素酶的最大吸附量分別為842.1 mg/g和911.4 mg/g，表明酚羥基含量增加可提高木質(zhì)素對纖維素酶的吸附能力。

3.2 木質(zhì)素間苯二酚與木質(zhì)素連苯三酚的脫附率分別為57.3%和30.2%，表明被吸附的纖維素酶更容易從木質(zhì)素間苯二酚中釋放。

3.3 被木質(zhì)素間苯二酚和木質(zhì)素連苯三酚吸附的纖維素酶的酶活保留率分別為57%和38%。