韋婷艷 楊杰 曾宇婷

[摘要] 目的 研究新生兒缺氧缺血性腦?。℉IE）患者胎盤組織中NLRP3炎性小體表達和氧化應(yīng)激狀態(tài)，探討NLRP3炎性小體和氧化應(yīng)激在HIE中的臨床意義。 方法 選擇廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院2010年7月～2019年5月HIE患者胎盤組織（HIE組）及正常胎盤組織（正常組）各30例，免疫組化法檢測兩組NLRP3表達。取兩組新鮮胎盤組織各10例，測定丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）濃度。并對兩組胎盤組織進行病理學評估。 結(jié)果 HIE組胎盤組織中有合體滋養(yǎng)葉細胞結(jié)節(jié)和有細胞滋養(yǎng)葉細胞的絨毛數(shù)量均高于正常組（P < 0.05），而具有血管合體細胞膜的絨毛數(shù)少于正常組（P < 0.05）。HIE組胎盤組織中的NLRP3表達量明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。HIE組的SOD活力低于正常組（P < 0.05），MDA含量高于正常組（P < 0.05）。NLRP3與SOD活力呈負相關(guān)（r = -0.63，P = 0.00），而與MDA含量呈正相關(guān)（r = 0.74，P = 0.00）。 結(jié)論 HIE新生兒胎盤組織中NLRP3炎癥小體表達明顯增加并存在異常氧化應(yīng)激，兩者存在相關(guān)性，其可能是新生兒HIE發(fā)生的原因。

[關(guān)鍵詞] 缺氧缺血性腦病;NLRP3炎癥小體;氧化應(yīng)激;胎盤

[中圖分類號] R714.43? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）03（b）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and oxidative stress of NLRP3 inflammasomes in the placenta of neonates with hypoxic-ischemic encephalopathy （HIE）， and to investigate the clinical significance of NLRP3 inflammasome and oxidative stress in HIE. Methods From July 2010 to May 2019， 30 cases of HIE placental tissue （HIE group） and 30 cases of normal placental tissue （normal group） were selected from Zengcheng District People′s Hospital， Guangzhou， NLRP3 expression was detected by immunohistochemistry. The concentrations of malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD） were measured in 10 fresh placental tissues， placental tissues of the two groups were pathologically evaluated. Results The number of villi with cytosygotrophoblast nodules and cytotrophoblast cells in the placenta tissues of neonates in HIE group was higher than that of normal group （P < 0.05）. The number of villi with cytosomal membrane was less than that of normal group （P < 0.05）. The expression level of NLRP3 in HIE group neonatal placenta was significantly higher than that in normal group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. SOD activity in HIE group was lower than that in normal group （P < 0.05）， and MDA content was higher than normal group （P < 0.05）. NLRP3 was negatively correlated with SOD activity （r = -0.63， P = 0.00）， while positively correlated with MDA content （r = 0.74， P = 0.00）. Conclusion There is a significant increase in the expression of NLRP3 inflammasomes in the placenta of neonates with HIE and abnormal oxidative stress， both of which are correlated， which may be the cause of neonatal HIE.

[Key words] Hypoxic-ischemic encephalopathy; NOD-like receptor protein 3 inflammasomes; Oxidative stress; Placenta

新生兒缺氧缺血性腦?。╤ypoxic-ischemi cencephalopathy，HIE）是因圍生期窒息或缺氧所致的腦血流減少性腦損傷，是新生兒死亡率和并發(fā)嚴重慢性疾病的最重要原因之一[1]。新生兒HIE發(fā)病機制復雜，尚未闡明。氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）由氧化與抗氧化作用失衡導致，在許多疾病中起著核心作用。OS在HIE發(fā)病機制和進展中發(fā)揮重要作用[2]。腦中樞組織受到多種有害損傷時其固有免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生炎性反應(yīng)，而固有免疫系統(tǒng)中模式識別受體NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體對于炎性反應(yīng)的誘導起到了重要作用[3]。在新生鼠缺氧缺血性腦損傷模型的腦組織中，NLRP3炎癥小體及其下游炎癥介質(zhì)表達升高，NLRP3可能介導和參與新生鼠缺氧缺血性腦損傷病程的發(fā)生與發(fā)展[4]。目前NLRP3炎癥小體在人類新生兒HIE中的作用及相關(guān)研究甚少報道。本研究分析新生兒HIE胎盤組織中NLRP3炎癥小體表達和OS狀態(tài)，探討NLRP3炎癥小體和OS在HIE中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2010年7月～2019年5月廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）出生的新生兒HIE患者中胎盤組織石蠟塊30例為HIE組，其中-80℃凍存的新鮮胎盤組織10例。按照中華醫(yī)學會兒科學會新生兒學組標準[5]，包括前置胎盤10例，胎盤早剝12例，妊娠高血壓綜合征妊娠6例，多胎妊娠2例。孕齡30～44周，平均（39.00±0.73）周。選取同期在我院出生的正常新生兒的胎盤石蠟組織30例作為正常組，其中-80℃凍存的新鮮胎盤組織10例。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性，見表1。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準并已獲得患者監(jiān)護人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 胎盤組織的病理學觀察? 所有病理石蠟組織均為4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。新鮮胎盤組織切取成小塊，生理鹽水清洗后于-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｋ惺灲M織4 μm厚切片，常規(guī)HE染色。采用盲法由有經(jīng)驗的高年資病理醫(yī)師在400×光學顯微鏡下觀察胎盤的病理組織學形態(tài)特征，隨機觀察10個不重復的高倍視野（high power field，HPF）。

1.2.2 免疫組織化學染色? 免疫組化試劑盒MaxVisionTM HRP（Mouse/Rabbit）（KIT-5002）、檸檬酸鹽抗原修復液（MVS-000），PBS緩沖液（PBS-0060）、DAB顯色劑（DAB-0031）均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。兔抗NLRP3多克隆抗體（ab214185）購自英國Abcam公司。30例HIE新生兒和30例正常新生兒胎盤的石蠟組織4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟水化，切片浸泡在修復液中高壓鍋加熱3 min，自然冷卻后PBS洗5 min×3次，3% H2O2室溫孵育10 min，PBS洗3 min×3次，加NLRP3抗體（稀釋度1∶200）于37℃水浴箱孵育1 h，PBS洗3 min×3次，加入MaxVisionTM HRP 孵育20 min，PBS洗3 min×3次，顯微鏡下DAB控色5～10 min，蘇木精復染核，常規(guī)封片。免疫組化染色結(jié)果參照文獻[6]，高年資病理醫(yī)師在雙盲情況下對切片染色結(jié)果進行判讀：染色強度按無色、淡黃色、棕黃色和棕褐色依次記0、1、2、3分。同樣物鏡下計數(shù)陽性細胞數(shù)，1%～10%記1分，<10%～50%記2分，<50%～75%記3分，>75%記4分。兩項得分相乘，滿3分為+，4分為++，≥5分為+++，+～+++為陽性表達。

1.2.3 氧化應(yīng)激指標的檢測? 從-80℃冰箱分別取出10名HIE新生兒和10例正常新生兒胎盤組織，勻漿處理后2000 r/min離心15 min（離心半徑10 cm），取上清檢測。超氧化物歧化酶（SOD）（A001-3）和丙二醛（MDA）測試盒（A003-1）均購自南京建成生物工程研究所，檢測按照說明書進行，在酶標儀（Thermo ScientificTM，MultiskanTM FC IVD型）450 nm和532 nm波長測定OD值。按試劑盒說明書給定的公式計算SOD活性和MDA含量：SOD活力（U/mgprot）=SOD抑制率（%）÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)（0.24 mL/0.02 mL）×樣本測試前稀釋倍數(shù);MDA含量（nmol/mgprot）=（測定OD值-對照OD值）/（標準OD值-空白OD值）×標準品濃度（10 nmol/mL）÷待測樣本蛋白濃度（mgprot/mL）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，比較采用兩獨立樣本t檢驗;計數(shù)資料采用百分率表示，比較采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組胎盤組織病理學觀察結(jié)果比較

HIE組胎盤組織中有合體滋養(yǎng)葉細胞結(jié)節(jié)和有細胞滋養(yǎng)葉細胞的絨毛數(shù)量均高于正常組（P < 0.05），而具有血管合體細胞膜的絨毛數(shù)少于正常組（P < 0.05）。見表2。

2.2 兩組胎盤組織中NLRP3的表達情況比較

NLRP3主要表達在胎盤合體滋養(yǎng)葉細胞的細胞質(zhì)中，呈棕黃色著色（圖1，見封三）。HIE胎盤組織中可見不同強度的NLRP3表達，正常胎盤組織中大部分不表達NLRP3，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表3。

2.3 兩組胎盤組織中SOD和MDA水平比較

HIE組新生兒胎盤組織中SOD活力明顯低于正常組（P < 0.05），MDA含量明顯高于正常組（P < 0.05）。見表4。

2.4 NLRP3與SOD、MDA的相關(guān)性分析

Spearman等級相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，NLRP3與SOD活力呈負相關(guān)（r = -0.66，P = 0.00），NLRP3與MDA呈正相關(guān)（r = 0.74，P = 0.00）。

3 討論

HIE病因復雜，涉及到氧化應(yīng)激損傷、炎性反應(yīng)等病理因素[7-9]，確切機制尚未闡明。由于新生兒腦內(nèi)糖原甚少，使其對缺血缺氧極其敏感。胎盤是母體向胎兒供血供氧的唯一通道，胎盤的異常會導致母胎之間血氣交換異常，從而影響胎兒生長和發(fā)育。本研究顯示新生兒HIE的胎盤組織發(fā)生了一定程度的病理改變。這些病理改變包括HIE胎盤組織的有合體滋養(yǎng)葉細胞結(jié)節(jié)和有細胞滋養(yǎng)葉細胞的絨毛數(shù)量均高于正常新生兒胎盤，而具有血管合體細胞膜的絨毛數(shù)比正常新生兒減少（P < 0.05）。新生兒HIE胎盤的這些病理改變，是由于低氧條件下導致的組織學形態(tài)[10]。

目前NLRP3在新生兒HIE胎盤組織中的研究較少。研究報道NLRP3在胎膜早破胎膜及胎盤組織中的表達升高[11]。在新生鼠HIE損傷模型的腦組織中，NLRP3炎癥小體及其下游炎癥介質(zhì)表達升高，NLRP3可能介導和參與新生鼠HIE損傷病程的發(fā)生與發(fā)展[4]。本研究NLRP3在新生兒HIE胎盤組織的表達明顯高于正常新生兒胎盤（P < 0.05）。新生兒HIE的發(fā)生會伴隨炎性反應(yīng)的出現(xiàn)[12]，而炎癥的發(fā)生離不開炎癥小體的參與[13-14]。NLRP3炎癥小體調(diào)控產(chǎn)生的多種炎癥介質(zhì)和因子介導免疫炎性反應(yīng)，從而產(chǎn)生一系列的級聯(lián)放大作用，促進炎性反應(yīng)和組織損傷進程[15]。作為母體向胎兒供血供氧的唯一通道，胎盤組織中NLRP3炎癥小體的表達增高，有可能通過激活下游多種炎癥介質(zhì)和因子，通過級聯(lián)放大作用介導腦部免疫炎性反應(yīng)和組織損傷，從而引起后續(xù)的HIE，但有待進一步研究證實。

正常妊娠期的氧化和抗氧化作用保持相對平衡，不會產(chǎn)生過度的OS[16-17]。有研究已證實OS在新生兒HIE的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[18-19]。本研究顯示新生兒HIE胎盤的SOD活力明顯低于正常新生兒胎盤的，MDA含量明顯高于正常新生兒胎盤組織，顯示新生兒HIE胎盤組織中存在過度OS。MDA是細胞膜磷脂中的多不飽和脂肪酸在受到活性氧攻擊后發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其水平升高說明組織中活性氧含量過多，被認為是檢測活性氧水平的指標[20]。SOD是體內(nèi)極為重要的抗氧化酶，具有強大的清除氧自由基的能力，SOD的活性在抵抗氧化劑產(chǎn)生及氧自由基中起著根本性的作用[20]。推測胎盤存在缺血缺氧后，導致活性氧產(chǎn)生，并且迅速增加的活性氧抵抗抗氧化劑的防御，最終導致過度的OS反應(yīng)。

本研究NLRP3與SOD活力呈密切負相關(guān)性，相反，與MDA呈密切正相關(guān)性。提示新生兒HIE胎盤中同時存在炎性反應(yīng)與OS，且二者相關(guān)性好。推測新生兒HIE胎盤組織中NLRP3炎癥小體表達明顯增加和存在異常OS可能是新生兒HIE發(fā)生的原因。進一步研究炎性反應(yīng)體和OS在新生兒HIE中的作用機制，將有望為預(yù)防和治療新生兒HIE提供新策略。

[參考文獻]

[1]? 王鑫，姜泓.新生兒缺氧缺血性腦病的病因和發(fā)病機制研究進展[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2019，36（2）：194-197.

[2]? Zhao M，Zhu P，F(xiàn)ujino M，et al. Oxidative Stress in Hypoxic-Ischemic Encephalopathy：Molecular Mechanisms and Therapeutic Strategies [J]. Int J Mol Sci，2016，17（12）：2078.

[3]? Schroder K，Kanneganti TD，Shao F，et al. Mechanism and Consequences of Inflammasome Activation [J]. J Mol Biol，2018，430（2）：131-132.

[4]? 李曉光，王茉琳，羅文哲，等.NLRP3炎性小體在缺氧缺血新生大鼠腦組織中的表達及意義[J].中華行為醫(yī)學與腦科學雜志，2017，26（1）：13-16.

[5]? 中華醫(yī)學會兒科學會新生兒學組.新生兒缺氧缺血性腦病診斷依據(jù)和臨床分度[J].中國實用兒科雜志，2000，15（6）：379-380.

[6]? 高鵬，莫春艷，龔洵，等.復發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛和蛻膜中NLRP3炎癥小體的差異性表達研究[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2018，27（10）：762-765.

[7]? Al Mamun A，Yu H，Romana S，et al. Inflammatory Responses are Sex Specific in Chronic Hypoxic-Ischemic Encep-halopathy [J]. Cell Transplant，2018，27（9）：1328-1339.

[8]? Al-Shargabi T，Govindan RB，Dave R，et al. Inflammatory cytokine response and reduced heart rate variability in newborns with hypoxic-ischemic encephalopathy [J]. J Perinatol，2017，37（6）：668-672.

[9]? Thurmond P，Yang JH，Li Y，et al. Structural modifications of the prostate in hypoxia，oxidative stress，and chronic ischemia [J]. Korean J Urol，2015，56（3）：187-196.

[10]? 譚運福，崔穎鵬.新生兒缺氧缺血性腦病的胎盤組織學定量學改變[J].實用醫(yī)學雜志，2004，20（6）：627-628.

[11]? 季美蕓，盧紅.NOD樣受體蛋白3、Toll樣受體2在胎膜早破患者胎盤和胎膜組織中的表達及其臨床意義[J].廣西醫(yī)學，2019，40（1）：33-38.

[12]? Yu-fei NI，Qiu-yan GU，Xiao-qin LI. Research Progress of Mechanism and Treatment of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy [J]. J Int Transl Med，2017，5（3）：117-122.

[13]? Schroder K，Kanneganti TD，Shao F，et al. Mechanism and Consequences of Inflammasome Activation [J]. J Mol Biol，2018，430（2）：131-132.

[14]? Coll RC，O′Neill L，Schroder K. Questions and controversies in innate immune research：what is the physiologicalrole of NLRP3？ [J]. Cell Death Discov，2016，2（1）：16019.

[15]? Mangan MSJ，Olhava EJ，Roush WR，et al. Targeting the NLRP3 inflammasome in inflammatory diseases [J]. Nature Reviews Drug Discovery，2018，17（9）：588-608.

[16]? de Andrade Ramos BR，Witkin SS. The influence of oxidative stress and autophagy cross regulation on pregnancy outcome [J]. Cell Stress Chaperones，2016，21（5）：755-762.

[17]? Lisha S，Pammal RS，Indu M，et al. Oxidative stress during early pregnancy and birth outcomes [J]. Public Health Nutr，2016，19（17）：3210-3215.

[18]? Zhao M，Zhu P，F(xiàn)ujino M，et al. Oxidative Stress in Hypoxic-Ischemic Encephalopathy：Molecular Mechanisms and Therapeutic Strategies [J]. Int J Mol Sci，2016，17（12）：2078.

[19]? Qin X，Cheng J，Zhong Y，et al. Mechanism and Treatment Related to Oxidative Stress in Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy [J]. Front Mol Neurosci，2019， 12：88.

[20]? 苗繪，孫艷美，張萍萍，等.酶抗氧化系統(tǒng)與復發(fā)性流產(chǎn)關(guān)系的研究進展[J].山東醫(yī)藥，2018，58（21）：98-10.

（收稿日期：2019-09-04? 本文編輯：封? ?華）