陳嘉媛 高莉 羅嘉楠

[摘要] 目的 探討類葉升麻苷對APP/PS1雙轉基因小鼠行為學和激素變化的影響。 方法 選取C57 BL/6J小鼠10只作為對照（A組），選取健康APP/PS1雙轉基因小鼠50只，以體重隨機分為B組（模型）、C組（多奈哌齊）、D組（類葉升麻苷低劑量）、E組（類葉升麻苷中劑量）、F組（類葉升麻苷高劑量），每組10只。連續(xù)給藥120 d后，進行O迷宮實驗，測定小鼠海馬Aβ1-40含量和血清、垂體中各激素含量。 結果 與A組比較，B組在O迷宮中進入開臂距離、時間均顯著縮短（P < 0.05）;與B組比較，D組在O迷宮中進入開臂距離、時間均顯著延長（P < 0.01），E組在O迷宮中進入開臂距離延長（P < 0.05）。與A組比較，B組海馬Aβ1-40含量顯著升高（P < 0.01）;與B組比較，E組海馬Aβ1-40含量顯著降低（P < 0.01）。與A組比較，B組血清促腎上腺皮質激素含量顯著升高（P < 0.05）;與B組比較，C組和F組血清促腎上腺皮質激素含量顯著降低，F(xiàn)組血清皮質醇含量顯著降低（P < 0.05）。與B組比較，D組垂體中促卵泡激素含量顯著降低（P < 0.05）。與A組比較，B組促甲狀腺激素含量顯著降低（P < 0.05）;與B組比較，C組、E組及F組促甲狀腺激素含量顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）。與A組比較，B組垂體中生長激素含量顯著降低（P < 0.05）;與B組比較，C組、E組及F組生長激素含量均顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）。 結論 類葉升麻苷可通過調節(jié)Aβ1-40含量及激素分泌，改善APP/PS1雙轉基因小鼠焦慮情緒，保護腦神經回路，提高記憶能力。

[關鍵詞] 類葉升麻苷;阿爾茨海默病;行為學;激素變化

[中圖分類號] R-332? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）03（b）-0009-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of acteoside on behavior and hormone changes of APP/PS1 double transgenic mice. Methods Ten mice of C57 BL/6J were selected as control （group A）. 50 healthy APP/PS1 double transgenic mice were randomly divided into group B （model）， group C （Donepezil）， group D （low dose of acteoside）， group E （medium dose of acteoside）， group F （high dose of acteoside）， 10 mice in each group. After 120 days of continuous administration， O maze test was carried out， and Aβ1-40 content in hippocampus of mice and the hormone content in serum and pituitary gland were determined. Results Compared with group A， the distance and time of arm opening in group B were significantly shortened （P < 0.05）; compared with group B， the distance and time of arm opening in group D were significantly lengthened （P < 0.01）， and the distance of arm opening in group E was lengthened （P < 0.05）. Compared with group A， the content of Aβ1-40 in group B increased significantly （P < 0.01）; compared with group B， the content of Aβ1-40 in group E decreased significantly （P < 0.01）. Compared with group A， the content of adrenocorticotropic hormone in group B was significantly increased （P < 0.05）; compared with group B， the content of adrenocorticotropic hormone in group C and group F was significantly decreased， and the content of cortisol in group F was significantly decreased （P < 0.05）. Compared with group B， follicle-stimulating hormone content in pituitary gland of group D decreased significantly （P < 0.05）. Compared with group A， thyroid-stimulating hormone content of group B was significantly decreased （P < 0.05）; compared with group B， thyroid-stimulating hormone content of group C， group E and group F was significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with group A， growth hormone content in pituitary of group B decreased significantly （P < 0.05）; compared with group B， growth hormone content of group C， group E and group F increased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Acteoside can improve the anxiety emotion of APP/PS1 double transgenic mice， protect the cerebral neural circuit and improve the memory ability by regulating the content of Aβ1-40 and the hormone secretion.

[Key words] Acteoside; Alzheimer disease; Behavioristics; Hormonal change

阿爾茨海默?。ˋD）是頻發(fā)于老年早期及老年期的一種相當復雜、嚴重并難以逆轉的神經退行性疾病[1-2]，其臨床研究結果指出，下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸激素與認知、衰老之間存在關聯(lián)性，提示HPG軸激素的變化與AD的神經病理學有關[3]。此外，下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸與AD之間也存在一定的關聯(lián)。這一現(xiàn)象直觀體現(xiàn)在AD女性患者多于男性上，女性對慢性壓力的敏感性增加可能會增加AD的風險。壓力誘導持續(xù)數年后易產生淀粉樣斑塊，應激激活HPA軸，從下丘腦和外周系統(tǒng)釋放促腎上腺皮質激素釋放激素（CORH），增加了Aβ、tau蛋白高磷酸化和血腦屏障的形成[4]。

類葉升麻苷具多種藥理活性，如抗氧化損傷、神經保護、肝臟保護、免疫調節(jié)、抗AD活性等。新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所新疆維吾爾醫(yī)方劑學重點實驗室（以下簡稱“本實驗室”）前期研究表明，類葉升麻苷能夠改善AD小鼠學習記憶障礙、焦慮情緒，以及抑制淀粉樣蛋白聚集的作用[5-10]。本實驗旨在研究類葉升麻苷對APP/PS1雙轉基因小鼠行為學和激素變化的影響，以期為類葉升麻苷可通過調節(jié)激素分泌改善APP/PS1雙轉基因小鼠焦慮情緒提出佐證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

O迷宮（XR-XZR209，上海欣軟信息科技有限公司）;Luminex分析儀（Lumi-nex-200，USA，Ensprie）;類葉升麻苷（本實驗室自制提取，純度≥98%，201510）;多奈哌齊（北京偶合科技有限公司，純度≥99%，150825）;氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司，1601093103）;烏拉坦（國藥集團化學試劑有限公司，T20111110）;酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海江萊生物有限公司，批號：JL11386）。

1.2 實驗動物

實驗組使用6月齡SPF級APP/PS1雙轉基因小鼠50只。對照組選用同月齡同背景的C57 BL/6J小鼠10只。出售單位：南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院，許可證號：SCXK（蘇）2015-0001，合格證號：201802110，由動物出售單位提供基因型鑒定報告。本實驗遵循了單位、地區(qū)或國家所制訂的有關實驗動物保護和使用指南，并經新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所實驗動物倫理委員會批準。

1.3 分組及給藥

小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，采用EXCEL軟件以SOP隨機分組法（根據體重和筑巢實驗結果）分為A組（C57 BL/6J小鼠，對照組）、B組（模型）、C組（多奈哌齊，2 mg/kg）、D組（類葉升麻苷低劑量，45 mg/kg）、E組（類葉升麻苷中劑量，60 mg/kg）;F組（類葉升麻苷高劑量，90 mg/kg），各10只。連續(xù)給藥120 d。

1.4 O迷宮

將小鼠放置在開、閉臂區(qū)間接點處，面向閉臂區(qū)間。迷宮設置選擇重心跟蹤法跟蹤識別，識別算法中選擇灰度法，調整灰度值。記錄5 min內小鼠穿越開臂區(qū)間的次數和停留在開臂區(qū)間的時間。

1.5 測定小鼠海馬中Aβ1-40含量

取處理好的海馬樣品上清，嚴格按照ELISA試劑盒說明書測試Aβ1-40的含量。

1.6 血清中促腎上腺皮質激素（ACTH）及皮質醇（CORT）含量測定

取處理好的血清樣本待測。使用“方法分析緩沖液”配置抗體固定珠，用純凈水或去離子水配制質量控制，血漿基質和“方法洗滌緩沖液”，使用Luminex 200測定血清中ACTH、CORT含量。

1.7 垂體中促甲狀腺激素（TSH）、促卵泡激素（FSH）及生長激素（GH）含量測定

取待測垂體，處理后用Luminnex 200測定TSH、FSH、GH的含量，具體檢測步驟同“1.6”中血清ACTH、CORT含量的測定。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠在O迷宮中進入開臂距離及時間比較

與A組比較，B組在O迷宮中進入開臂距離、時間均顯著縮短（P < 0.05）;與B組比較，D組在O迷宮中進入開臂距離、時間均顯著延長（P < 0.01），E組在O迷宮中進入開臂距離延長（P < 0.05）。見圖1。

2.2 各組小鼠海馬Aβ1-40含量比較

與A組比較，B組海馬Aβ1-40含量顯著升高（P < 0.01）;與B組比較，E組海馬Aβ1-40含量顯著降低（P < 0.01）。見圖2。

2.3 各組小鼠血清ACTH及CORT含量比較

與A組比較，B組血清ACTH含量顯著升高（P < 0.05）;與B組比較，C組和F組血清ACTH含量顯著降低，F(xiàn)組血清CORT含量顯著降低（P < 0.05）。見圖3。

2.4 各組小鼠垂體中FSH含量比較

與B組比較，D組垂體中FSH含量顯著降低（P < 0.05）。見圖4。

2.5 各組小鼠垂體中TSH含量比較

與A組比較，B組TSH含量顯著降低（P < 0.05）;與B組比較，C組、E組及F組TSH含量顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）。見圖5。

2.6 各組小鼠垂體中GH含量比較

與A組比較，B組垂體中GH含量顯著降低（P < 0.05）;與B組比較，C組、E組及F組GH含量均顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）。見圖6。

3 討論

焦慮是AD的重要表現(xiàn)之一[11]。O迷宮可判斷動物的焦慮狀態(tài)[12]。本實驗O迷宮結果提示類葉升麻苷可以緩解APP/PS1模型小鼠由于癡呆造成焦慮的情緒。Aβ為APP中較為重要的一個片段，現(xiàn)下大部分學者認為，AD發(fā)病過程中的關鍵環(huán)節(jié)是APP基因異常代謝產生Aβ沉淀[13-14]。本實驗中ELISA數據提示類葉升麻苷可以降低APP/PS1小鼠海馬中Aβ1-40的含量。

CORH在調節(jié)HPA中起著重要作用[15]。CORH對ACTH釋放的作用被加壓素強烈增強，當下丘腦室旁神經元被慢性激活時，加壓素的共同分泌量會增加。ACTH的釋放導致CORT的釋放，隨后，通過礦皮質激素和糖皮質激素受體，對海馬體、垂體和下丘腦等施加負反饋[16-17]。此外，HPA軸與HPG軸之間存在密切的相互作用，兩者均與老年癡呆癥密切相關[18]。

目前甲狀腺功能異常明顯影響到老年人認知功能障礙，其在神經系統(tǒng)發(fā)育、神經功能調節(jié)等方面的重要性也日益受到關注[19]。正常狀況下，垂體分泌TSH，TSH則刺激甲狀腺細胞分泌甲狀腺素和三碘甲腺原氨酸，以保證HPT軸的穩(wěn)定[20-21]。本實驗中B組實驗鼠體內TSH含量明顯降低，打破了甲狀腺激素分泌的穩(wěn)定性，類葉升麻苷則能通過影響HPT軸有效改善甲狀腺激素的分泌，從而達到防治老年癡呆的目的。

從本實驗結果可以發(fā)現(xiàn)，類葉升麻苷不同劑量的藥物對不同激素的影響也不盡相同，聯(lián)系行為學數據可知，F(xiàn)組的類葉升麻苷對腦神經回路影響較大，且能通過影響激素達到這一目的，如HPG軸的變化，而D組對小鼠焦慮情緒的緩解有更大幫助。類葉升麻苷對于HPA軸、HPG軸與HPT軸中所含激素的分泌均有良好的改善效果，這無疑為類葉升麻苷在AD中的治療研究打了一劑強心針。

綜上所述，類葉升麻苷能緩解APP/PS1小鼠的躁狂情緒，降低APP/PS1小鼠海馬中Aβ1-40的含量;可有效改善APP/PS1小鼠血液中HPA軸亢進的現(xiàn)象;能作用于HPG軸，抑制FSH的分泌;亦能作用于HPT軸，有效地升高TSH、GH。初步提示類葉升麻苷可通過改善焦慮情緒、影響激素變化等途徑起到治防老年癡呆的作用，其作用機制有待于進一步的深入研究。

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（收稿日期：2019-09-24? 本文編輯：李亞聰）