陳曉潔　郭玲宇　張萍

【摘要】目的 觀察慢病毒載體介導(dǎo)的易洛魁家族同源盒1（IRX1）基因沉默對宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法 培養(yǎng)宮頸癌SiHa細(xì)胞并分為3組：其中未做任何處理的SiHa細(xì)胞為Control組、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的SiHa細(xì)胞為sh-NC組、轉(zhuǎn)染IRX1短發(fā)夾RNA（shRNA）重組慢病毒載體質(zhì)粒的SiHa細(xì)胞為sh-IRX1組。實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白免疫印跡法分別在IRX1 mRNA和蛋白表達(dá)水平上鑒定轉(zhuǎn)染效果，CCK-8法和克隆形成試驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞增殖能力變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化，蛋白免疫印跡法檢測SiHa細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、細(xì)胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）、B淋巴細(xì)胞瘤（BCL）關(guān)聯(lián)X蛋白（BAX）和BCL-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與Control組和sh-NC組比較，sh-IRX1組SiHa細(xì)胞中IRX1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，SiHa細(xì)胞活性和克隆形成能力均降低，G0/G1期細(xì)胞比例增多，S期和G2/M期細(xì)胞比例減少，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中PCNA、Cyclin D1和BCL-2蛋白表達(dá)水平下調(diào)，BAX蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P均< 0.05）。結(jié)論 慢病毒載體介導(dǎo)IRX1基因沉默可抑制人宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】易洛魁家族同源盒1基因;宮頸癌SiHa細(xì)胞;增殖;凋亡

【Abstract】Objective To observe the effect of lentiviral vector-mediated Iroquois homeobox 1 （IRX1） gene silencing on the proliferation and apoptosis of cervical cancer SiHa cells. Methods Primary Cervical cancer SiHa cells were cultured and divided into three groups. In the control groups， cervical cancer SiHa cells were untreated. In the sh-NC group， cervical cancer SiHa cells were transfected with empty plasmid. In the sh-IRX1 group， human cervical cancer SiHa cells were transfected with the IRX1 shRNA recombinant lentiviral vector. The transfection efficiency of IRX1 expression at the mRNA and protein levels was evaluated by real-time PCR and Western blot， respectively. The changes in the proliferation of SiHa cells after transfection were detected by CCK-8 assay and colony formation assay. The cell cycle and apoptosis of SiHa cells were detected by flow cytometry. The expression levels of PCNA， Cyclin D1， BAX and BCL-2 proteins in SiHa cells were measured by Western blot. Results After transfection of IRX1 shRNA lentiviral vector， the expression levels of IRX1 mRNA and protein in SiHa cells were significantly down-regulated compared with those in the control and sh-NC groups （both P < 0.05）. After IRX1 gene silencing， SiHa cell activity and clone formation ability were significantly decreased. The G0/G1 phase cell ratio was significantly increased， whereas the S phase and G2/M phase cell ratios were dramatically decreased. The cell apoptosis rate was remarkably elevated. The expression levels of PCNA， Cyclin D1 and BCL-2 proteins were significantly down-regulated， whereas that of BAX protein was significantly up-regulated （all P < 0.05）. Conclusion Lentiviral vector-mediated IRX1 gene silencing can inhibit the proliferation of human cervical cancer SiHa cells and promote cell apoptosis.

【Key words】Iroquois homeobox 1 gene;Cervical cancer SiHa cells;Proliferation;Apoptosis

宮頸癌是女性第二高發(fā)惡性腫瘤，也是女性惡性腫瘤死亡的第三大原因[1]。根據(jù)近年我國的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，女性中宮頸癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[2-3]。目前，宮頸癌的治療方式主要有手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療，但患者的生存率仍未能明顯提高[4-5]。隨著分子生物學(xué)及醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，基因治療在包括宮頸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中取得突破性的進(jìn)展[6-8]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一種涉及多因素、多步驟的繁雜過程，其中促癌基因和抑癌基因的異常表達(dá)均可參與惡性腫瘤的發(fā)病[9-12]。易洛魁家族同源盒1（IRX1）基因與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、胚胎發(fā)育等密切相關(guān)[13-14]。研究顯示，IRX1通過介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)行為在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15-16]。亦有研究顯示IRX1在宮頸癌中呈高表達(dá)，且與宮頸癌的臨床分期密切相關(guān)[17]。然而，IRX1在宮頸癌中的功能及作用機(jī)制鮮有報(bào)道。因此，本研究探究IRX1對宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期為宮頸癌的基因治療提供作用靶點(diǎn)。

材料與方法

一、材 料

人宮頸癌細(xì)胞株SiHa細(xì)胞株（美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心），DMEM培養(yǎng)基（美國Sigma公司），胎牛血清、胰蛋白酶、Opi-MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司），CCK-8試劑（日本TaKaRa公司），IRX1短發(fā)夾RNA（shRNA）重組慢病毒載體質(zhì)粒及空載質(zhì)粒（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司），細(xì)胞蛋白提取試劑盒（美國Pierce公司），BCA蛋白濃度檢測試劑盒、電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑及蛋白免疫印跡法檢測所需試劑（上海碧云天生物技術(shù)研究所），鼠抗人IRX1、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、細(xì)胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）、B淋巴細(xì)胞瘤（BCL）關(guān)聯(lián)X蛋白（BAX）和BCL-2蛋白抗體及山羊抗鼠二抗（美國Cell Sigaling Technology公司）。

二、方 法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌SiHa細(xì)胞株用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞貼壁生長融合度達(dá)90%后，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)期的SiHa細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

2. 細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染和分組

對數(shù)生長期的SiHa細(xì)胞以胰酶消化，計(jì)數(shù)后以1×105/孔接種到6孔板中，將細(xì)胞分為3組：其中未做任何處理的SiHa細(xì)胞為Control組、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的SiHa細(xì)胞為sh-NC組、轉(zhuǎn)染IRX1 shRNA重組慢病毒載體質(zhì)粒的SiHa細(xì)胞為sh-IRX1組。轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格參照慢病毒轉(zhuǎn)染及Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，轉(zhuǎn)染后篩選并收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SiHa細(xì)胞。

3. IRX1基因表達(dá)水平的檢測

使用實(shí)時(shí)定量PCR法。分別收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組SiHa細(xì)胞，利用Trizol試劑裂解并提取細(xì)胞中總RNA，以分光光度計(jì)對提取RNA的純度和濃度進(jìn)行鑒定。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行加樣和擴(kuò)增，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈模板DNA，并以GAPDH為內(nèi)參基因，使用SYBR premix Ex Taq Kit試劑盒行實(shí)時(shí)定量PCR檢測。反應(yīng)體系包括2倍SYBR premix 10 μl、模板DNA 2 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、DEPC水6 μl。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性30 s、60℃退火20 s共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸30 s。待反應(yīng)結(jié)束后，分析熔鏈曲線確定產(chǎn)物的特異性，并獲得Ct值，-△△CT=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，以相對定量2-△△CT法分別計(jì)算各組SiHa細(xì)胞中IRX1 mRNA相對表達(dá)量。IRX1上游引物序列5-AGTTAAAGTCGCCCTTCCAG-3，下游引物序列5-CCCCGCAAAAGTAAAAGAAGAC-3，產(chǎn)物長度120 bp;GAPDH上游引物序列5-GATAC ACGGAGCACCAGGTT-3，下游引物序列5-CAGG TCACATACACGGTTGC-3，產(chǎn)物長度158 bp。

4. IRX1、PCNA、Cyclin D1、BAX和BCL-2蛋白表達(dá)水平的檢測

使用蛋白免疫印跡法。轉(zhuǎn)染48 h后各組SiHa細(xì)胞以胰酶消化，離心收集細(xì)胞，使用蛋白提取試劑盒提取各組SiHa細(xì)胞中總蛋白。加入適量上樣緩沖液與蛋白混勻，加熱變性，取30 μg蛋白進(jìn)行加樣，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。在5%脫脂奶粉的封閉液中封阻2 h。TBST緩沖液洗膜，分別加入相應(yīng)一抗，一抗按照使用說明書進(jìn)行稀釋，4℃過夜雜交，TBST洗膜后加入1∶2000稀釋的二抗，室溫雜交1 h。TBST洗膜后以ECL顯色，于暗室中使用凝膠成像系統(tǒng)成像拍照。以GAPDH進(jìn)行標(biāo)定，使用Quantity One軟件分析各蛋白條帶灰度值。分別計(jì)算各組SiHa細(xì)胞中目的蛋白相對表達(dá)水平。

5. IRX1對SiHa細(xì)胞增殖能力影響的檢測

采用CCK-8法。對數(shù)生長期的SiHa細(xì)胞接種到96孔板中，接種密度為1×103/孔，在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長密度達(dá)50%左右時(shí)按前述方法進(jìn)行分組和轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)分別向每孔細(xì)胞加入100 μl CCK-8溶液，37℃繼續(xù)孵育4 h，使用多功能酶標(biāo)儀測定450 nm波長處細(xì)胞吸光度（OD）值。

6. IRX1對SiHa細(xì)胞增殖影響的檢測

采用克隆形成試驗(yàn)。各組處于對數(shù)生長期SiHa細(xì)胞以胰酶消化，離心收集細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后分別以8×102/孔接種到6孔板中，將接種好的細(xì)胞放置在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)約14 d，

直至大部分細(xì)胞克隆數(shù)大于50時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，取出6孔板，向各孔細(xì)胞中加入1 ml多聚甲醛固定1 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后再向細(xì)胞中加入500 μl Giemsa染色液，染色20 min，清水洗滌3次，對各組細(xì)胞克隆數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

7. IRX1對SiHa細(xì)胞周期及凋亡影響檢測

采用流式細(xì)胞術(shù)。轉(zhuǎn)染后的各組SiHa細(xì)胞以胰酶消化，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，離心收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為3×105/ml，加入預(yù)冷的70%的乙醇對細(xì)胞進(jìn)行固定。離心棄上清，加入預(yù)冷的PBS 200 μl洗滌細(xì)胞2次。向細(xì)胞中加入20 μl RNA酶，置37 ℃下孵育30 min，再加入400 μl 碘化丙啶（PI）染液，置于冰上，避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期比例。另收集轉(zhuǎn)染后的各組SiHa細(xì)胞，加入100 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再向細(xì)胞懸液中加入異硫氰酸熒光素Annexin V-FITC和PI各5 μl，

混勻后避光孵育30 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以表示，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、慢病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定沉默IRX1基因的SiHa細(xì)胞株

sh-IRX1組SiHa細(xì)胞中IRX1 mRNA和蛋白相對表達(dá)水平均低于Control組和sh-NC組（P < 0.05），而Control組和sh-NC組IRX1 mRNA和蛋白相對表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），見圖1、表1。

二、IRX1對SiHa細(xì)胞增殖的影響

從轉(zhuǎn)染48 h開始，sh-IRX1組SiHa細(xì)胞OD值均低于Control組和sh-NC組（P均< 0.05），而Control組和sh-NC組SiHa細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)OD值比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）。另外，sh-IRX1組SiHa細(xì)胞克隆形成數(shù)均少于Control組和sh-NC組（P均< 0.05），而Control組和sh-NC組SiHa細(xì)胞克隆形成數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），見表2。

三、IRX1對SiHa細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，sh-IRX1組G0/G1期細(xì)胞百分比均高于Control組和sh-NC組（P均< 0.05），S期和G2/M期細(xì)胞百分比均低于sh-IRX1組（P均< 0.05），而Control組和sh-NC組各時(shí)期細(xì)胞百分比比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），見表3。

四、IRX1對SiHa細(xì)胞凋亡的影響

sh-IRX1組SiHa細(xì)胞凋亡率為（21.94± 3.24）%，均高于Control組的（3.36±0.55）%和sh-NC組的（3.82±0.57）%，P均< 0.05。Control組和sh-NC組SiHa細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），見圖2。

五、IRX1對SiHa細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平的影響

sh-IRX1組SiHa細(xì)胞中PCNA、Cyclin D1和BCL-2蛋白表達(dá)水平均低于Control組和sh-NC組（P均< 0.05），其BAX蛋白表達(dá)水平高于Control組和sh-IRX1組（P均< 0.05），而Control組和sh-NC組SiHa細(xì)胞中PCNA、Cyclin D1、BAX和BCL-2蛋白表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），見表4、圖3。

討論

既往研究顯示，IRX1在多種腫瘤中起抑癌基因或促癌基因的作用[18]。Liu等[19]研究表明，蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5（PRMT5）作為IRX1的主要上游調(diào)節(jié)劑通過誘導(dǎo)IRX1的表觀遺傳沉默促進(jìn)胃癌細(xì)胞的致瘤性和轉(zhuǎn)移。IRX1 mRNA在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)量顯著高于相應(yīng)癌旁組織，IRX1基因的異常高表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長[20]。以上這些研究顯示出IRX1基因的抑癌作用。然而，在Lu等[21]的研究中，IRX1在人骨肉瘤細(xì)胞系和臨床骨肉瘤組織中過表達(dá)，體外研究顯示，IRX1通過上調(diào)CXCL14/NF-κB信號傳導(dǎo)通路促進(jìn)細(xì)胞體外遷移和侵襲。另一項(xiàng)研究顯示，IRX1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)高于正常腦組織及癌旁組織，且與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)[22]。

Zhang等[23]報(bào)道指出，在膠質(zhì)瘤組織和U373、LN229和T98G細(xì)胞中IRX1的表達(dá)升高，其表達(dá)量與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的總體存活率呈正相關(guān)，提示基因可能在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表現(xiàn)出致癌作用。這些研究顯示出IRX1基因的促癌作用，并提示IRX1在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用可能與其表達(dá)量有關(guān)。何楊等[17]指出，IRX1在宮頸癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)顯著升高，提示IRX1可能促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展?；谝酝芯拷Y(jié)果，本研究通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染IRX1 shRNA至宮頸癌SiHa細(xì)胞，探究沉默IRX1基因?qū)iHa細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

本研究顯示，宮頸癌SiHa細(xì)胞中IRX1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低，表明穩(wěn)定沉默IRX1基因的SiHa細(xì)胞株構(gòu)建成功。CCK-8和克隆形成試驗(yàn)顯示，沉默IRX1基因能夠抑制SiHa細(xì)胞增殖能力。這與Yu等[24]關(guān)于IRX1能夠調(diào)節(jié)牙釉質(zhì)外上皮和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增殖和分化的研究類似。PCNA是增殖細(xì)胞核抗原，僅存在于增殖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，與細(xì)胞中DNA合成密切相關(guān)，且能夠啟動細(xì)胞增殖，是反映細(xì)胞處于增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)[25]。Cyclin D1是一類細(xì)胞周期蛋白，其在進(jìn)化上高度保守，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，且在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用[26]。本研究顯示，沉默IRX1基因后SiHa細(xì)胞中PCNA和Cyclin D1蛋白表達(dá)下調(diào)，提示沉默IRX1對SiHa細(xì)胞增殖抑制作用可能與下調(diào)PCNA和Cyclin D1的表達(dá)有關(guān)。此外流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，沉默IRX1基因能夠阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。BAX和BCL-2屬于BCL-2蛋白家族，在細(xì)胞凋亡過程中扮演重要角色[27]。BAX是主要的凋亡促進(jìn)因子，其編碼的BAX蛋白可與BCL-2結(jié)合形成異二聚體，當(dāng)BAX含量增多時(shí)可阻抑BCL-2對細(xì)胞的保護(hù)作用誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[28]。本研究顯示，沉默IRX1基因能夠上調(diào)SiHa細(xì)胞中BAX的表達(dá)，下調(diào)BCL-2的表達(dá)，表明沉默IRX1基因可能通過上調(diào)BAX的表達(dá)及下調(diào)BCL-2的表達(dá)促進(jìn)SiHa細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究表明沉默IRX1基因能夠抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其潛在作用機(jī)制可能與調(diào)控PCNA、Cyclin D1、BAX和BCL-2的表達(dá)有關(guān)。然而，IRX1在宮頸癌中的確切作用機(jī)制尚不清楚，仍有待進(jìn)一步探究。隨著對IRX1的不斷深入了解，相信IRX1有可能成為宮頸癌診斷和治療的潛在作用靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2019-11-25）

（本文編輯：林燕薇）