吳 菲 初 蕾 李夢(mèng)辭 劉 穎 陳丕銘 吳麗更

口腔牙菌斑生物膜是由多種微生物組成的復(fù)雜生物膜，其上寄生超過(guò)700 多種微生物[1]，在這個(gè)群體中生活著許多細(xì)菌，它們通過(guò)自身或者相互粘附作用，定植到宿主的牙齒表面，形成一定厚度的生物膜，這種能力在牙菌斑生物膜形成的過(guò)程中，發(fā)揮著重要的作用[2]。變異鏈球菌（簡(jiǎn)稱變鏈）是目前公認(rèn)的致齲能力最強(qiáng)的一種口腔致病菌[3]，其粘附定植于牙菌斑生物膜中是導(dǎo)致齲病發(fā)生的重要因素。寡發(fā)酵鏈球菌（簡(jiǎn)稱寡鏈）是2003 年由佟卉春等[4]首次從人口腔牙菌斑中分離出的一株新的口腔鏈球菌，已發(fā)現(xiàn)寡鏈對(duì)變鏈生長(zhǎng)有抑制作用。蔗糖有著最強(qiáng)的致齲能力[5]。變鏈可以利用食物中的蔗糖合成葡聚糖促進(jìn)自身及其它細(xì)菌粘附到牙齒表面形成牙菌斑，從而增強(qiáng)了變鏈的致齲能力[6]。目前體外研究發(fā)現(xiàn)，寡鏈和血鏈球菌（簡(jiǎn)稱血鏈）能夠通過(guò)產(chǎn)過(guò)氧化氫抑制變鏈的生長(zhǎng)，且寡鏈產(chǎn)過(guò)氧化氫的能力強(qiáng)于血鏈[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道在一定情況下，血鏈能夠抑制變鏈的粘附[7]。因此，本研究通過(guò)建立蔗糖環(huán)境下比較寡鏈和變鏈，血鏈和變鏈雙菌株生物膜模型下的細(xì)菌間抑制作用，從而更深一步了解寡鏈作為有益菌在維持口腔微生態(tài)環(huán)境中的生物學(xué)作用。

資料和方法

1.材料和儀器

寡發(fā)酵鏈球菌（中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，中國(guó)），血鏈球菌ATCC10556（中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，中國(guó)），變異鏈球菌ATCC10449（四川大學(xué)口腔生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)），細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱（YQX 型上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，中國(guó)），激光共聚焦顯微鏡（OlympusFV3000，上海冉超光電科技有限公司，中國(guó)），蔗糖（Alphasense，美國(guó)），高速離心機(jī)（Eppendorf 5415D，上海中貿(mào)集團(tuán)有限公司，中國(guó)），胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司，中國(guó)），BacLight Live/Dead 染色劑（Molecular Probes，Eugene，Oregon，美國(guó)）。

2.唾液采集

按照參考文獻(xiàn)[8]的方法取數(shù)名健康成年人靜止唾液，上離心機(jī)（10000×g，20 分鐘），離心，后提取唾液上清液，4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩４褂脮r(shí)用孔徑為0.22μm 的無(wú)菌一次性濾過(guò)膜過(guò)濾滅菌。

3.建立唾液包被體外粘附模型

參考文獻(xiàn)[8]的方法將100μL 滅菌過(guò)的唾液加入無(wú)菌玻璃管中，于恒溫培養(yǎng)箱調(diào)至37℃恒溫下靜置30 分鐘，創(chuàng)建成唾液包被的玻璃模型。

4.菌落計(jì)數(shù)法測(cè)量蔗糖環(huán)境下寡鏈和血鏈對(duì)變鏈的抑制能力

將雙菌株模型每種細(xì)菌各200μl，分別加入1600μL 含1%蔗糖濃度和1600μL 不含蔗糖的大豆胰蛋白培養(yǎng)液（簡(jiǎn)稱TSB）的玻璃管中，單菌株模型各200μl，分別加入1800μL 含1%蔗糖濃度和1800μL 不含蔗糖的TSB 的玻璃管中，將不同組玻璃管傾斜18 度，分別放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)24 小時(shí)后，取出，用3ml 磷酸緩沖鹽溶液（簡(jiǎn)稱PBS）沖洗3 次，然后再滴入1ml PBS，用手振蕩五次后，分別取出100μl 稀釋液，用腦心浸液培養(yǎng)液（簡(jiǎn)稱BHI）系列稀釋。取10μl 菌液在BHI 固體培養(yǎng)基上接種并培養(yǎng)24 小時(shí)，然后采用細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

5.激光共聚焦顯微鏡下觀察蔗糖環(huán)境對(duì)寡鏈，血鏈和變鏈單雙菌株模型生物膜形成的影響

按照參考文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行。在800μl 含1%蔗糖濃度的TSB 液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中加入雙菌株細(xì)菌，每種細(xì)菌各50μl；在800μl 不含蔗糖的TSB液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中加入雙菌株細(xì)菌，每種細(xì)菌各50μl，在800μl 含有1%蔗糖濃度的TSB 液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中加入單菌株模型每種細(xì)菌各100μl；在800μl 不含蔗糖的TSB 液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中加入單菌株模型每種細(xì)菌各100μl，培養(yǎng)24小時(shí)，其中未粘附的細(xì)菌，用1ml 蒸餾水沖去，再滴加100μl 染色劑BacLight Live/Dead，避光后，染色，15 分鐘后，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

應(yīng)用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)菌落計(jì)數(shù)法和激光共聚焦顯微鏡下測(cè)量不同蔗糖環(huán)境下寡鏈和血鏈對(duì)變鏈抑制能力的比較，進(jìn)行雙因素定量資料單變量方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.運(yùn)用細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)蔗糖環(huán)境下，單雙菌株模型中細(xì)菌之間的相互作用

無(wú)糖環(huán)境下，單菌株模型中菌落數(shù)：血鏈＞變鏈，但二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）血鏈＞寡鏈（P＜0.05），變鏈＞寡鏈（P＜0.05）。雙菌株模型中寡鏈和變鏈，血鏈和變鏈共培養(yǎng)后，二者菌落數(shù)與單菌株相比均降低，且變鏈降低幅度更大，血鏈菌落數(shù)與單菌株相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。雙菌株共培養(yǎng)模型中，變鏈菌落數(shù)降低幅度：寡鏈組＜血鏈組。

蔗糖環(huán)境下，單菌株模型中菌落數(shù)：變鏈＞血鏈＞寡鏈，三者之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。雙菌株寡鏈和變鏈，血鏈和變鏈共培養(yǎng)后，二者菌落數(shù)與單菌株相比均降低，且變鏈降低幅度更大，血鏈菌落數(shù)與單菌株相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。雙菌株共培養(yǎng)模型中，變鏈菌落數(shù)降低幅度：寡鏈組＞血鏈組。

寡鏈和變鏈單菌株菌落數(shù)，在蔗糖環(huán)境下均高于無(wú)糖環(huán)境；血鏈單菌株菌落數(shù)在蔗糖環(huán)境下低于無(wú)糖環(huán)境。雙菌株模型中變鏈菌落數(shù)降低幅度，寡鏈組在蔗糖環(huán)境下大于無(wú)糖環(huán)境。血鏈組在蔗糖環(huán)境下小于無(wú)糖環(huán)境。見(jiàn)表1。

表1 蔗糖環(huán)境下單菌株寡鏈，血鏈，變鏈及雙菌株寡鏈組，血鏈組分別培養(yǎng)24h 后細(xì)菌菌落數(shù)（108CFU/mL，±s）

2.激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)蔗糖環(huán)境對(duì)單雙菌株模型中各細(xì)菌生物膜形成的影響

無(wú)糖環(huán)境下，生物膜厚度：?jiǎn)尉昴Ｐ椭?，血鏈?17.23±3.82μm，變鏈為 15.16±4.21μm，寡鏈為10.54±4.37μm。雙菌株生物膜模型中生物膜厚度：寡鏈組為11.27±3.55μm，血鏈組為8.12±2.82μm。

蔗糖環(huán)境下生物膜厚度：?jiǎn)尉昴Ｐ椭?，變鏈?0.63±5.71μm，血鏈為，13.37±4.93μm，寡鏈為12.45±4.62μm。雙菌株生物膜模型中生物膜厚度：寡鏈組為6.67±2.19μm，血鏈組為10.45±2.72μm，見(jiàn)圖1。

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察不同蔗糖濃度下雙菌株生物膜的厚度。o+m 代表共培養(yǎng)寡鏈組，s+m 代表共培養(yǎng)血鏈組。A 代表無(wú)糖環(huán)境，B 代表蔗糖環(huán)境。

討 論

口腔環(huán)境與外界環(huán)境有頻繁的物質(zhì)交換，口腔內(nèi)微生物的繁殖和代謝均受外界環(huán)境因素的影響和改變，由此可見(jiàn)，細(xì)菌之間的共存模式也會(huì)受到外界環(huán)境因素的影響和制約[10]。在眾多碳水化合物中，蔗糖被認(rèn)為是致齲能力最強(qiáng)的糖，因?yàn)樗鼙灰恍┲慢x細(xì)菌如變異鏈球菌，酵解產(chǎn)酸，并且生成一些多糖，這些多糖大多不溶于水，從而使細(xì)菌聚集粘附滯留在牙菌斑上，導(dǎo)致齲病的發(fā)生[5]。

本研究選擇了無(wú)糖和有糖兩種環(huán)境進(jìn)行研究[6]。菌落計(jì)數(shù)法顯示，蔗糖環(huán)境下，變鏈的粘附能力強(qiáng)于血鏈，但兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而寡鏈的粘附能力最弱。有研究證實(shí)變鏈利用蔗糖合成葡聚糖促進(jìn)自身粘附到牙齒表面，從而造成低pH 環(huán)境（產(chǎn)酸），并且在低pH 環(huán)境下，變鏈比其它細(xì)菌更容易產(chǎn)酸和耐酸，這與我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，變鏈在糖環(huán)境下，較寡鏈和血鏈有著較強(qiáng)的粘附能力，形成牙菌斑[12]，從而增強(qiáng)了變鏈的致齲能力。

雙菌株培養(yǎng)模型寡鏈和變鏈、血鏈和變鏈各細(xì)菌的菌落數(shù)較單菌株比均降低，我們分析這與細(xì)菌的相互競(jìng)爭(zhēng)拮抗作用有關(guān)[11]。蔗糖環(huán)境下，寡鏈和變鏈共培養(yǎng)后變鏈菌落數(shù)的降低幅度比血鏈和變鏈共培養(yǎng)后降低的幅度更大。提示在蔗糖環(huán)境下，寡鏈較血鏈有著較強(qiáng)的抑制變鏈粘附的能力，佟卉春等人研究已發(fā)現(xiàn)寡鏈通過(guò)產(chǎn)過(guò)氧化氫來(lái)抑制變鏈的生長(zhǎng)，其產(chǎn)過(guò)氧化氫的能力約為血鏈的十倍[4]，并且Bao[12]等人發(fā)現(xiàn)蔗糖環(huán)境不影響寡鏈過(guò)氧化氫的產(chǎn)量，因此，我們分析蔗糖環(huán)境共培養(yǎng)后寡鏈較血鏈仍具有較強(qiáng)的產(chǎn)過(guò)氧化氫的能力，從而較血鏈有更強(qiáng)的抑制變鏈生物膜形成的能力。

無(wú)糖環(huán)境下，血鏈粘附能力強(qiáng)于變鏈，寡鏈最弱，三者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。雙菌株培養(yǎng)模型中，變鏈菌落數(shù)的降低幅度，血鏈組大于寡鏈組。無(wú)糖環(huán)境下，血鏈對(duì)變鏈的粘附抑制能力強(qiáng)于寡鏈，而血鏈在糖環(huán)境下對(duì)變鏈的抑制能力較無(wú)糖環(huán)境下明顯減弱，這與Kreth 等人[13]的研究結(jié)果相一致。而在蔗糖環(huán)境下，寡鏈對(duì)變鏈的粘附抑制能力強(qiáng)于血鏈，由此我們認(rèn)為，寡鏈較血鏈在糖環(huán)境下有更強(qiáng)的抑制變鏈粘附的能力。

運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡，采用不同顏色的熒光蛋白標(biāo)記寡鏈，變鏈和血鏈，觀察其在生物膜中的生長(zhǎng)情況，即生物膜厚度，寡鏈和變鏈在1%蔗糖環(huán)境下厚于無(wú)糖環(huán)境，變鏈生物膜厚度與寡鏈相比更厚，表明在蔗糖環(huán)境下變鏈的生長(zhǎng)優(yōu)于寡鏈，而雙菌株培養(yǎng)后，變鏈的生物膜厚度降低，1%蔗糖環(huán)境下降低幅度最大，雙菌株共培養(yǎng)，血鏈組中，在無(wú)糖環(huán)境下的生物膜厚度降低幅度最大，這與上述菌落計(jì)數(shù)法的結(jié)果相一致。因此，我們認(rèn)為，在一定條件的蔗糖環(huán)境下，抑制變鏈粘附的能力上，寡鏈強(qiáng)于血鏈。

激光共聚焦顯微鏡通過(guò)對(duì)細(xì)菌及其生物膜中的各種成分進(jìn)行染色，染色后通過(guò)無(wú)損傷的連續(xù)斷層掃面，從而得到細(xì)菌生物膜各種直觀圖像，并且可以進(jìn)行三維圖像重建[14]，因此被認(rèn)為是目前較為理想的研究細(xì)菌的方法[15]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)細(xì)菌及生物膜的菌體和多糖成份分別標(biāo)記，可直接在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌及其生物膜形成過(guò)程進(jìn)行觀察，操作過(guò)程中大大減少生物膜的減少與缺損。

綜上所述，寡鏈具有抑制變鏈粘附的能力，且蔗糖環(huán)境下，抑制能力增強(qiáng)。蔗糖環(huán)境下，寡鏈對(duì)變鏈的抑制能力強(qiáng)于血鏈。在無(wú)糖環(huán)境下，血鏈對(duì)變鏈的抑制能力優(yōu)于有糖環(huán)境，由此可見(jiàn)，在一定濃度的糖環(huán)境下，寡鏈對(duì)變鏈粘附的抑制能力強(qiáng)于血鏈。本研究主要方向局限于體外模型討論變鏈接抗菌對(duì)變鏈粘附的抑制能力，而在體內(nèi)模型中，是否具有該抑制能力，尚需進(jìn)一步研究。