楊月美 李 寧 孫 旭 王君妍 白冰清

黑色素瘤是由源于神經(jīng)嵴的黑色素細(xì)胞異常增殖而形成的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)口腔黑色素瘤占口腔腫瘤的0.5%，占全身黑色素瘤的0.2%～8%，每10萬例亞洲人或太平洋島民中有0.17 例的口腔黑色素瘤患者[1]。對口腔粘膜黑色素瘤患者進(jìn)行回顧性分析結(jié)果表明，完全切除根治性治療的預(yù)后較好[2]，但原發(fā)于口腔的黑色素瘤表現(xiàn)出向深層組織浸潤，不易觀察且具有高轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、易經(jīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，80%病例發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，無法實(shí)現(xiàn)根治性切除，并且口腔黑色素瘤預(yù)后比皮膚黑素瘤差，總體5 年生存率為10～25%[3]。目前尚無合理有效的治療藥物。Dong.Y 等人體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PTEN 基因通過調(diào)節(jié)劑對黑色素瘤細(xì)胞的宿主免疫應(yīng)答發(fā)揮抑制劑的作用[4]。有研究證實(shí)PTEN 表達(dá)的喪失改變了細(xì)胞因子分泌模式，從而產(chǎn)生免疫抑制性微環(huán)境，并增加可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的免疫細(xì)胞群，從而促進(jìn)免疫逃逸[5]。因此，我們旨在構(gòu)建PTEN 基因不同表達(dá)的黑色素瘤小鼠模型，為進(jìn)一步研究PTEN 基因的不同表達(dá)在黑色素瘤免疫逃逸中的作用機(jī)制及黑色素瘤的發(fā)病機(jī)理、臨床藥物研發(fā)提供合適模型。

資料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.動物：15 只雄性 C57BL/6 小鼠，6～8 周，18～21 克，購自河北醫(yī)科大學(xué)動物中心（許可證號SCXK（京）2019-0006）。

2.細(xì)胞：（PTEN+/+-B16F10）細(xì)胞株（購于中橋新舟公司）。

3.主要試劑：BbsI 酶（NEB 公司）質(zhì)粒抽提試劑盒 （ 北京天根生物科技有限公司）Lipofectamine@3000 轉(zhuǎn)染試劑（THERMO 公司）高保真 DNA 聚合酶（TOYOBO 公司）兔抗人 PTEN 單克隆抗體（MILLIPORE 公司）鼠抗人GAPDH 單克隆抗體（ABCOM 公司）辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔IgG（上海泊灣生物技術(shù)有限公司）

二、研究內(nèi)容

1.敲除細(xì)胞株P(guān)TEN 基因

（1）1gRNA 的設(shè)計(jì)：利用 Cas9/gRNA 網(wǎng)站（http://crispr.mit.edu/） 為 PTEN 基因（位置 8960） 設(shè)計(jì)gRNA 堿 基 序 列：PTEN-gRNA F:CACCGGCTAAC GATCTCTTTGATGA；PTEN-gRNA R:AAACTCATCA AAGAGATCGTTAGCC

（2）載體構(gòu)建：通過BbsI 酶切鏈接反應(yīng)裝到改造的PX330 載體（含有嘌呤霉素篩選基因）。①gRNA：gRNA 由invitrogen 公司合成后，稀釋至作用濃度20μM；②合成的gRNA 寡核苷酸單鏈退火成雙鏈：5μl F+R（20μM），5μl buffer2，雙蒸水 50μl，置于沸水后自然冷卻至室溫；③連接體系:PX330 質(zhì)粒 1μl，退火形成雙鏈的 gRNA 3μl，T4 連接酶 0.5μl，T4DNA 連接酶buffer 1μl，25℃連接2h；④轉(zhuǎn)化：感受態(tài)細(xì)胞（DH5a）50μl，加入 5μl 連接產(chǎn)物，冰上孵育30min，42℃水浴鍋熱激，冰上放置2min 后，轉(zhuǎn)移20μl 混合液至含有氨芐青霉素的LB 固態(tài)培養(yǎng)基上涂勻，37℃培養(yǎng)16h 取出；⑤挑菌送測序：挑取單克隆置于1ml 含有Amp 抗生素的LB 液體培養(yǎng)基中，搖菌8h 后，按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取和純化質(zhì)粒PX330-PTEN-gRNA，送至鉑尚生物技術(shù)有限公司測序驗(yàn)證。

（3）細(xì)胞轉(zhuǎn)染：復(fù)蘇（PTEN+/+-B16F10）細(xì)胞傳代至密度達(dá)到60%左右時(shí)按照Lipofectamine@3000 轉(zhuǎn)染試劑說明將質(zhì)粒PX330-PTEN-gRNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

（4）PTEN 基因敲除細(xì)胞的篩選：PX330-PTEN-gRNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞48h 后，將存活的細(xì)胞重新消化，并按一定的密度培養(yǎng)單克隆細(xì)胞系，細(xì)胞擴(kuò)增并編號冷凍大部分，剩余部分分別用高保真DNA 聚合酶PCR 擴(kuò)增gRNA 結(jié)合的序列，鑒定PCR 的引物序列F：（5'CCGCTGCCTCGGCTGC CAGGCC3'）和R：（5'AGGTCAAGTCTAAGTCGAATC C3'），引物由invitrogen 公司合成，所得產(chǎn)物送鉑尚公司測序分析，獲得陽性敲除細(xì)胞株（PTEN-/--B16F10）。

2.細(xì)胞培養(yǎng)

兩種細(xì)胞分別置于含10%滅活胎牛血清、1%雙抗的 RPMI-1640 培養(yǎng)液，37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)。

3.動物分組

15 只小鼠隨機(jī)分為三組，每組五只，背部正中備皮，面積約為2cm×2cm，75%乙醇消毒。對照組：注入0.2ml 的RPMI-1640 培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)組A：注入0.2ml濃度為 4×106/ml 的（PTEN+/+-B16F10）；實(shí)驗(yàn)組 B：注入 0.2ml 濃度為 4×106/ml 的（PTEN-/--B16F10）。

4.記錄

自注射日起，每天觀察小鼠進(jìn)食、行動情況，待實(shí)驗(yàn)組所有小鼠背部均觸及綠豆大小黑結(jié)節(jié)時(shí)，當(dāng)天視為出瘤日（D0）。以四天為一觀察單位測量小鼠腫瘤的長徑（a）短徑（b），V＝ab2/2（mm3）計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。至實(shí)驗(yàn)組小鼠80%出現(xiàn)精神萎靡時(shí)停止實(shí)驗(yàn)。

5.標(biāo)本采集及處理

小鼠脫頸后取下腫瘤組織，稱重并分別取100mg A、B 兩組小鼠腫瘤組織新鮮標(biāo)本，提蛋白后-80℃保存。

6.組織蛋白鑒定

提取兩種細(xì)胞蛋白，測定蛋白濃度，加緩沖液后煮沸，按等量的總蛋白上樣，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，100V 恒壓轉(zhuǎn)模1h，5%脫脂奶粉封閉1h，將兔抗人PTEN 單克隆抗體和兔抗人GAPDH 單克隆抗體用稀釋液稀釋，比例均為1:3000，4℃孵育搖床過夜、漂洗；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，稀釋，比例為1:2500，孵育1h，化學(xué)發(fā)光、顯影、壓片。

7.結(jié)果分析

SPSS25.0 軟件處理數(shù)據(jù)。均值 -T 檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.兩種細(xì)胞PTEN基因測序

為鑒定PTEN 基因敲除效果，提取克隆細(xì)胞DNA 測序分析，與原基因序列相比，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后細(xì)胞基因測序缺少一個(gè)堿基。據(jù)編碼規(guī)律，三個(gè)堿基編碼一個(gè)氨基酸，后面堿基全部移碼錯位，致PTEN蛋白缺失表達(dá)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)

與（PTEN-/--B16F10）相比，（PTEN+/+-B16F10）形態(tài)較扁長，生長速率較慢。

3.荷瘤小鼠生長狀態(tài)

注射第7 天（D0），實(shí)驗(yàn)組小鼠背部均可觸及綠豆大小質(zhì)硬結(jié)節(jié)；生長過程中可見腫瘤破潰結(jié)痂現(xiàn)象，周圍有明顯血管；注射第16 天，實(shí)驗(yàn)組80%小鼠精神萎靡停止實(shí)驗(yàn)。

4.記錄數(shù)據(jù)并繪制曲線

分別在 D0、D4、D8、D12、D16 天測量 A、B 兩組腫瘤體積，記錄并繪制腫瘤生長曲線。A 組小鼠腫瘤生長速度小于B 組，兩組比較有統(tǒng)計(jì)差異（D0，P＝0.011；D4，P＝0；D8，P＝0.005；D12，P＝0；D16，P＝0.005）。

5.細(xì)胞及腫瘤組織免疫印跡結(jié)果

圖1 （PTEN+/+-B16F10）基因組原始測序結(jié)果

圖2 （PTEN+/+-B16F10）和（PTEN-/--B16F10）靶序列編碼氨基酸的變化

圖3 相同狀態(tài)下細(xì)胞圖像（熒光倒置顯微鏡 ×100）

圖4 注射當(dāng)天、D0、D4、D8、D12、D16 天三組小鼠

表1 兩組小鼠腫瘤體積參數(shù)比較（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

圖5 小鼠腫瘤體積隨時(shí)間變化的圖像

圖6 免疫印跡檢測細(xì)胞和腫瘤組織PTEN 表達(dá)

提取兩種細(xì)胞和成瘤組織中的蛋白檢測，可觀察到（PTEN+/+-B16F10）細(xì)胞和A 組小鼠腫瘤標(biāo)本中PTEN 蛋白表達(dá)，（PTEN-/--B16F10）細(xì)胞和 B 組小鼠腫瘤標(biāo)本中PTEN 蛋白不表達(dá)。

討 論

1997 年，PeterA.Steck 等人首次發(fā)現(xiàn) 10q23.3 染色體的TEP1/MMAC1 是一個(gè)抑癌基因，后改名為PTEN，該基因與人類多種惡性腫瘤形成有關(guān)[6]。在黑色素瘤中，PTEN 的失活多達(dá)30%[7]。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過敲除PTEN 基因可以模擬機(jī)體PTEN 失活的狀態(tài)。自2013 年Cong L 等人運(yùn)用CRISPR-Cas9 系統(tǒng)在真核細(xì)胞進(jìn)行基因編輯以來，CRISPR-Cas9 技術(shù)獲得迅猛發(fā)展，在基礎(chǔ)研究中，尤其是在涉及致癌作用的單基因功能研究中至關(guān)重要。由于腫瘤發(fā)生和發(fā)展是多種遺傳改變，目前該技術(shù)可以模擬基因突變和缺失，用來產(chǎn)生細(xì)胞和動物模型以了解該基因在腫瘤發(fā)生中的作用[8，9]。Cas9/gRNA 在基因編輯中具有高效性和特異性，可用于編輯DNA 或調(diào)節(jié)真核細(xì)胞和生物體中基因表達(dá)[10]。2018 年，Shen Y 等人用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系中的 PTEN 基因生成了 PTEN-KO 細(xì)胞系[11]；2019 年，Simbulan 等人運(yùn)用CRISPR-Cas9 技術(shù)發(fā)現(xiàn)：CD133可能通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2/MMP9 而在侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[12]。2019 年，Colette Moses 等人運(yùn)用CRISPR-Cas9 技術(shù)成功在BRAF 突變黑素瘤 SK-MEL-28 中特異性激活PTEN[13]?？梢娺\(yùn)用該技術(shù)敲除PTEN 基因是建立PTEN 基因缺失動物模型的技術(shù)關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用 CRISPR-Cas9 技術(shù)成功敲除（PTEN+/+-B16F10）細(xì)胞的 PTEN 基因，構(gòu)建了（PTEN-/--B16F10）細(xì)胞系。

使用荷瘤小鼠模型可以在動物體內(nèi)觀察黑色素瘤對動物免疫功能的影響，這種體內(nèi)實(shí)驗(yàn)比體外實(shí)驗(yàn)更有說服力。黑色素瘤的發(fā)生是免疫系統(tǒng)減弱同時(shí)機(jī)體內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化而促進(jìn)黑色素瘤生長。本實(shí)驗(yàn)建立PTEN 基因缺失表達(dá)的體內(nèi)模型，能控制唯一變量研究PTEN 基因與黑色素瘤兩者之間的關(guān)系。B16F10 細(xì)胞是C57BL/6 小鼠來源的，與裸鼠相比能模擬機(jī)體免疫系統(tǒng)減弱的過程，使免疫排斥降到最低，這更符合患者黑色素瘤發(fā)生的體內(nèi)過程，為此我們選C57BL/6 小鼠作為載體。本實(shí)驗(yàn)將兩種細(xì)胞接種到小鼠皮下，7 天均能在小鼠皮下形成綠豆大小的實(shí)體瘤，兩組小鼠的成瘤率均為100%。結(jié)果分析A、B 兩組小鼠腫瘤體積比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），說明PTEN 基因與腫瘤的生長有相關(guān)性。

研究細(xì)胞分子性狀在動物模型上是否發(fā)生變化，常采用免疫印跡技術(shù)。此技術(shù)可用來鑒定、半定量分析細(xì)胞和腫瘤組織的目的蛋白，因特異性強(qiáng)，靈敏度高及成本低等優(yōu)點(diǎn)廣泛用于實(shí)驗(yàn)[14]。本實(shí)驗(yàn)用免疫印跡檢測PTEN 蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示兩種細(xì)胞在接種前后PTEN 蛋白均能保持原狀態(tài)，（PTEN+/+-B16F10） 細(xì)胞與A 組小鼠腫瘤組織中PTEN 蛋白表達(dá)呈陽性，（PTEN-/--B16F10）細(xì)胞與 B組小鼠腫瘤組織中PTEN 蛋白表達(dá)呈陰性，證實(shí)模型鑒定成功。