戴顯寧 陳茜 王倩 王海堅 童郁 許鍇

耳聾是造成兒童言語交流障礙的最常見原因之一。據全國第二次殘疾人抽樣調查顯示，我國現有的聽力障礙患者約2 000余萬，其中0～6歲聽力障礙兒童超80萬。50%以上的聽力障礙兒童是遺傳性易感體質，且90%以上的聾兒出生于聽力正常、沒有耳聾家族史的家庭[1]。由于耳毒性藥物使用不當導致的聽力障礙兒童約占30%～40%[2-4]，其中20%～30%的藥物性耳聾患者存在線粒體DNA（mtDNA）突變[5-6]。研究報道位于mtDNA 12S rRNA基因上的1494C＞T及1555A＞G位點突變可使部分攜帶者對氨基糖甙類抗生素超敏感，從而出現臨床上常見的“一針致聾”現象[7-10]。因此，本研究通過對溫州市特殊教育學校186例耳聾患者進行mtDNA 12S rRNA基因篩查及家系分析，明確部分藥物性耳聾患者的發(fā)病原因，提高患者用藥安全性，通過遺傳咨詢?yōu)橄乱淮烂@治聾提供依據，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 2016至2018年期間溫州市人民醫(yī)院共對溫州特殊教育學校192例耳聾患者進行耳聾基因篩查，排除3例Warrdenburg綜合征、2例Pendred綜合征以及1例耳聾伴骨骼發(fā)育異?；颊?，最終本研究共納入186例非綜合征耳聾患者作為研究對象。排除標準：（1）明確有外耳或中耳先天性畸形患者；（2）綜合征性耳聾患者；（3）伴有其它先天性疾病患者（如：先天性心臟病、染色體異常等）。其中男104例，女82例；年齡6～16（11.4±2.9）歲；37例有使用氨基糖甙類藥物史，占19.9%。臨床資料以書面問卷調查形式開展，包括患者的發(fā)病誘因、發(fā)病年齡、聽力損失嚴重程度、抗生素用藥史、家族遺傳史等。本研究經溫州市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員批準，檢查前告知患者監(jiān)護人基因篩查可能存在的風險并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 聽力檢測 由溫州市人民醫(yī)院的耳鼻喉科醫(yī)師在溫州特殊教育學校使用AD266純音聽閾測試儀對患者進行聽力檢測，聽力損失嚴重程度按世界衛(wèi)生組織耳聾分級標準分類[11]，見表1。

表1 聽力損失分級標準

1.2.2 mtDNA 12S rRNA基因篩查 患者均抽取靜脈血3～5ml，EDTA-K2抗凝。采用蘇州天隆生物科技有限公司試劑盒（批號：E0819050121）提取全血基因組DNA，提取過程嚴格按照試劑盒說明書操作。用德國恒通SMA-4000型紫外分光光度計測定DNA濃度和純度，待測DNA于-20℃保存。mtDNA 12S rRNA目的片段引物設計參照文獻[12]，并由杭州擎科生物工程技術有限公司合成，Mit-1F：5′-CTCCTCAAAGCAATACACTG-3′；Mit-1R：5′-TGCTAAATCCACCTTCGACC-3′;Mit-2F：5′-CGATCAACCTCACCACCTCT-3′;Mit-2R：5′-TGGACA ACCAGCTATACCA-3′。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，35 個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產物送至杭州擎科生物工程技術有限公司進行Sanger測序。

1.2.3 結果分析 測序結果采用DNAstar2.0生物學軟件進行分析。采用Clustal X 2.0生物學軟件將人類mtDNA 12S rRNA基因序列與12種靈長類動物相應序列進行種間并對，計算保守指數（conservation index，CI）。CI≥75%時提示該位點較保守[13]。

2 結果

2.1 患者mtDNA 12S rRNA基因篩查結果 186例患者mtDNA 12S rRNA基因共篩查出變異類型16種（均已有報道）。與氨基糖甙類明確相關的1555A＞G位點突變10例，占5.4%，其中男7例，女3例，聽力損失程度從輕度至極重度不等。計算變異位點保守性發(fā)現CI＞75%的變異位點包括 827A＞G、1095T＞C、1107T＞C、1382A＞C、1431G＞A、1541T＞C、1555A＞G，見表 2。

表2 186例患者mtDNA 12S rRNA基因篩查變異位點

2.2 攜帶mtDNA 12S rRNA基因1555A＞G位點突變患者家系分析 該10例患者的家系評估、遺傳學特征分析顯示家系平均耳聾外顯率（母系成員耳聾患者/所有母系成員）約為26.8%。聽力損失程度和發(fā)病年齡也表現出一定程度差異（表3），母系成員多表現為聽力正常，呈散發(fā)性。其中WZ-152家系存在1555A＞G和1095T＞C雙位點突變，WZ163家系存在1555A＞G和961insC雙位點突變。7個家系的先證者（家系中第1個被本研究確診為耳聾的人，即本研究耳聾基因檢測患者，家系圖中箭頭所示）有氨基糖甙類藥物史，耳聾外顯率分別為 33.3%、20.0%、28.6%、50.0%、20.0%、42.9%、25.0%，平均外顯率為31.4%。3個非藥物耳聾家系的外顯率分別為16.7%、25.0%、25.0%；平均外顯率為22.2%，見圖1。

表3 10例攜帶mtDNA 12S rRNA基因1555A＞G位點突變患者相關臨床資料

圖1 10例攜帶mtDNA 12S rRNA基因1555A＞G位點突變患者家系圖（箭頭所指為先證者）

3 討論

耳聾是嚴重影響人們正常生活的常見健康問題之一，其中藥物性耳聾是新生兒先天性或后天性聾及成人后天性耳聾的主要原因，約20%～30%的藥物性耳聾患者因存在mtDNA突變，對氨基糖甙類藥物極其敏感。氨基糖甙類抗生素致聾可分為兩類，一類因使用耳毒性藥物而致聾；另一類有遺傳背景或易感體質，即攜帶mtDNA 12S rRNA的1494C＞T及1555A＞G突變位點。這類人群接觸一次或低劑量氨基糖甙類藥物即可能致聽力損失。耳聾患者多在用藥數天后出現聽力下降，逐步加重。且臨床表現上主要以耳聾、耳鳴為主，多雙側對稱及高頻聽力缺失，可逐漸向低頻聽力缺失發(fā)展，少數患者甚至繼續(xù)惡化，至全聾。

本研究通過對溫州特殊教育學校186例耳聾患者mtDNA 12S rRNA檢測，篩選出變異類型16種，其中與藥物性耳聾相關的1555A＞G位點突變10例，突變率為5.4%，低于李守霞等[14]報道的邢臺市特教學校耳聾患者1555A＞G位點突變的7.5%，高于彭光華等[15]報道的浙江省7所聾校456例患者1555A＞G位點突變的4.4%?？赡茉驗闃颖救脒x數量、地區(qū)性差異，環(huán)境因素及遺傳背景等在疾病的發(fā)生發(fā)展與表現上有著不同程度的影響。龔莎莎等[15]研究報道稱僅在中國患者和西班牙患者家系中發(fā)現了1494C＞T位點突變，但本研究結果未見1494C＞T位點突變。此外，本研究還發(fā)現其他一些可能與耳聾相關的突變位點，如彭光華等[16]報道的1095T＞C位點，CI高達92.9%，該位點在對照組和一些藥物性耳聾患者中均有出現，可能造成結構上一定程度的改變，具有功能意義，但本身不足以造成耳聾表型。同樣也有研究表明961 insC位點可能也與非綜合征聾有關[17]。1999年，Casano等[18]報道了1例氨基糖甙類藥物致聾家系同時存在A1555G和961insC雙位點突變，該研究表明961位點C插入可能導致mtDNA 12S rRNA的結構發(fā)生改變，從而影響氨基糖甙類藥物的結合。但目前尚無關于961insC位點突變單獨導致耳聾發(fā)生的情況報道，因此提示961insC可能協(xié)同A1555G突變增加家系中耳聾外顯率及表現度，導致A1555G突變患者對氨基糖甙類藥物產生超敏性。此外，其余變異位點在對照組和患者中攜帶比率都較高或者CI較低，可能是線粒體單體型特異位點[19]。

本研究186例非綜合征耳聾患者中明確有氨基糖甙類藥物史占19.9%，但與藥物性耳聾相關的1555A＞G位點突變率僅為5.4%，可能是由于本研究僅篩查了mtDNA 12S rRNA相關熱點區(qū)域，導致了由于mtDNA上其他繼發(fā)位點突變造成的藥物性耳聾患者的漏篩。因此，需進一步完善本研究mtDNA上其他位點的篩查。從10例攜帶1555A＞G位點突變的耳聾家系圖中可以看出，只有小部分母系成員表現耳聾，而絕大多數成員都表現為聽力正常，平均外顯率僅26.8%，聽力損失程度和發(fā)病年齡也表現一定程度差異性，且同一家系母系成員或不同家系成員之間在聽力損失嚴重程度、抗生素使用情況及耳聾外顯率等方面均存在明顯差異，提示1555A＞G基因突變本身可能不是造成耳聾的唯一原因，可能原因是區(qū)別于核基因突變，mtDNA突變存在閾值效應，當突變的mtDNA達到一定的比例時，才有受損的表型出現，即同質突變和異質突變。但不同個體細胞內突變mtDNA閾值又受核基因、環(huán)境等影響而呈現個體差異性。從而導致部分攜帶者用藥后仍表現聽力正?；蜉p度下降。因此其他修飾因子如繼發(fā)突變、線粒體單倍型和核修飾基因等可能參與調節(jié)耳聾的外顯率及表型表達[20]。

由此可見，mtDNA 12S rRNA突變是部分氨基糖甙類藥物致聾患者的分子基礎，但突變并不是造成耳聾的唯一因素，其他修飾因子如繼發(fā)突變、線粒體單體型和核基因調控等均有可能影響耳聾的外顯率及表型表達。但對于基因攜帶者可以通過評估家族成員藥物敏感史和mtDNA基因篩查提高耳聾患者使用氨基糖甙類抗生素治療的安全性，同時對于耳聾患者婚配及生育指導有著重要的社會意義，可為下一代防聾治聾提供依據。