陳亞茹 趙丹 劉馨馨 馬國英 楊曉萍 羅星

(石河子大學醫(yī)學院 1生化教研室，新疆 石河子 832002；2第一附屬醫(yī)院腎病科)

慢性腎臟病(CKD)是一種以進行性腎功能退化和不可逆轉的腎臟損害為基本特征的慢性疾病，其病理機制多種多樣，臨床表現(xiàn)為尿蛋白的大量丟失。腎小球濾過屏障的破壞是造成大量蛋白尿的原因。構成濾過膜屏障的腎小球內(nèi)皮細胞、腎小球基底膜和足細胞結構破壞均可導致蛋白尿的產(chǎn)生〔1〕。尤其是足細胞，被認為在腎小球血液濾過屏障中發(fā)揮主導優(yōu)勢，其獨特足突的病變是導致 CKD 的關鍵。足突相互交錯的細胞間連接被稱為裂隙隔膜(SD)。足細胞裂隙隔膜分子(nephrin)作為 SD 濾過網(wǎng)絡的核心成分，不僅影響足細胞極性、細胞存活，還是細胞內(nèi)區(qū)域相互作用的的信號支架〔2〕。

骨化三醇，即活性維生素D3〔1,25-(OH)2D3〕，是維生素D3的生物活性分子，在一些神經(jīng)炎癥性疾病(神經(jīng)性脊髓炎視神經(jīng)病變)、代謝性疾病(高血壓、糖尿病)及各類慢性腎臟疾病中發(fā)揮重要作用〔3，4〕。研究發(fā)現(xiàn)，維生素 D 水平的缺乏不僅對骨骼的正常礦化、肌肉收縮、神經(jīng)傳導產(chǎn)生有害影響，還促進蛋白尿的產(chǎn)生，加重CKD的病程〔3〕。本實驗通過研究1，25-(OH)2D3對阿霉素(ADR)腎病大鼠腎損傷及足細胞 nephrin 表達的影響，探討其發(fā)揮重要的腎保護作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物來源 90 只6周齡雄性 SPF 級 Sprague Dawley(SD) 大鼠，體重 180～220 g，購自新疆醫(yī)科大學,動物許可證號：SCXK(新)2013-0001，所有實驗動物飼養(yǎng)在石河子大學轉化醫(yī)學動物實驗室。

1.1.2藥物與試劑 注射用鹽酸多柔比星(ADR)(深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號：H44024360)；1,25-(OH)2D3膠丸(上海羅氏制藥有限公司，批號：J20150011)；Anti-nephrin antibody(美國 Abcam 公司，批號：ab183099)；抗 GAPDH 鼠單克隆抗體(北京康為世紀公司生物科技有限公司，批號：201509)；羅丹明標記山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋生物技術有限公司,批號：ZF-0316)

1.1.3儀器設備 熒光顯微鏡、光學顯微鏡(日本Olympus公司)；低溫高速離心機(美國 Thermo Fisher 公司)；蒸汽滅菌高壓鍋(美國 Thermo Scientific 公司)；電泳儀、電轉膜儀(美國 Bio-Rad有限公司)；手掌型離心機(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物模型建立 隨機選取60只大鼠，采用單次尾靜脈注射ADR造模。將ADR溶于生理鹽水至2 mg/ml，大鼠稱重后固定，酒精棉球擦拭尾部使血管充盈，以 7.5 mg/kg ADR 行單次尾靜脈注射。由于ADR外滲易造成爛尾現(xiàn)象，故注射完畢后，干棉球按壓5 min止血。余30只大鼠作為對照接受等量的0.9%氯化鈉注射液。

1.2.2分組與給藥 注射ADR 1 w后檢測造模效果，24 h UP 水平>30 mg/(100 g·d)的大鼠為模型成功。將造模大鼠隨機均分為ADR腎病組、1,25-(OH)2D3治療組(ADR+VD組)及對照大鼠作Control組；每粒1,25-(OH)2D3膠丸溶于3 ml的金龍魚花生油，ADR+VD組每天給予 0.25 μg /kg 1,25-(OH)2D3灌胃治療；Control 組及ADR 腎病組接受等量的花生油灌胃。實驗長達10 w。

1.2.3腎功能指標檢測 每治療2 w末，留尿檢測24 h UP、腹主靜脈采血全自動生化分析儀檢測Alb、BUN、Cre指標；稱體重及雙腎重，雙腎重與體重的比值為腎臟系數(shù)。

1.2.4腎病理學觀察 4 μm 的石蠟切片經(jīng)組織化學染色〔蘇木素-伊紅(HE)染色、馬松三色染色(Masson)〕，以400倍圖像下每張切片隨機選取10個腎小球視野，Image pro plus 6.0 圖像分析，以系膜基質面積占腎小球面積百分比表示腎小球系膜基質增生指數(shù)，以膠原纖維在腎組織含量的百分比表示腎臟組織的纖維化程度。1 mm3腎皮質，經(jīng)預冷的 2.5% 戊二醛固定，1% 鋨酸再固定，用乙醇和環(huán)氧丙烷分級脫水，將脫水后的樣品嵌入環(huán)氧丙烷和環(huán)氧樹脂混合物，乙酸鈾酰和檸檬酸鉛進行雙重染色觀察超微結構。

1.2.5免疫熒光染色 4 μm石蠟切片脫蠟脫二甲苯后，3% 過氧化氫(H2O2) 避光孵育20 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，0.25% 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)室溫透膜30 min，5%胎牛血清白蛋白(BSA)37℃ 封閉50 min，nephrin抗體(1∶300)4℃孵育過夜；次日復溫 30 min，PBS 浸洗5 min×3次后加入羅丹明標記山羊抗兔二抗(1∶200)，避光濕盒37℃孵育1 h，PBS 洗后，加一滴(50 μl)含4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)抗熒光衰減封片劑，暗室熒光顯微鏡觀察。

1.2.6免疫組織化學檢測nephrin表達 4 μm腎組織石蠟切片經(jīng)脫蠟，抗原修復，內(nèi)源性過氧化物酶封閉后，nephrin 一抗(1∶1 000) 4℃孵育過夜；次日復溫，免疫組化通用二抗孵育半小時；免疫原復合物用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)標記 2 min，HE復染15 s，自來水浸洗玻片3遍，經(jīng)梯度酒精和二甲苯脫水透明，晾干覆蓋蓋玻片。400倍視野下，每張切片隨機選取10個腎小球視野，Image pro plus 6.0 軟件處理數(shù)據(jù)，以陽性區(qū)積分光密度(IOD)與其面積(Area)比代表相對表達量。

1.2.7Western印跡法檢測 nephrin 蛋白表達以組織/細胞裂解液(RIPA) 與苯甲基磺酰氟(PMSF)比為100∶1的比例裂解腎皮質，提取總蛋白，加入蛋白上樣緩沖液后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將蛋白轉移至硝酸纖維素(NC)膜上后，孵育在含有nephrin(1∶1 000)的 5% 的脫脂奶粉中，4℃搖床過夜；山羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫比例孵育2 h，增強型化學發(fā)光試劑顯影。以 GAPDH 為內(nèi)參，Image J 測量其灰度值。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件進行方差分析，組間多重比較，采用LSD檢驗。

2 結 果

2.1大鼠一般狀況 Control 組大鼠飲食、飲水量較佳，毛色順滑有光澤，精力充沛，大便成形；ADR腎病組大鼠飲食、飲水量有所下降，毛色暗黃無光澤，四肢肌張力明顯減弱，便不成形，墊料易潮濕。ADR+VD 組大鼠各不良癥狀有所改善，但較Control組略差。

2.2各組腎功能指標比較 1,25-(OH)2D3治療8 w，各生化指標檢測顯示：與 Control 組比較，ADR 腎病組大鼠24 h UP、BUN、Cre、腎臟系數(shù)顯著增高(均P<0.05)，Alb 顯著下降(均P<0.05)；ADR+VD組24 h UP、BUN、Cre顯著升高(P<0.05)。與ADR腎病組比，ADR+VD組24 h UP、BUN、Cre、腎臟系數(shù)顯著降低(均P<0.05)，而 Alb水平升高(均P<0.05)?？梢姡?,25-(OH)2D3能夠減輕蛋白尿，改善ADR引起的腎功能降低。見表1。

表1 各組腎功能指標的比較

與Control 組相比:1)P<0.05;與 ADR 腎病組相比:2)P<0.05，下表同

2.3各組腎組織結構的改變 腎病理學染色顯示：與Control組比，ADR 腎病組大鼠腎組織出現(xiàn)炎性細胞浸潤、基底膜增厚、系膜基質增多(P<0.05)、大量纖維增生(P<0.05)、超微結構進一步顯示足細胞損傷，呈足突“熔蠟樣”融合；ADR+VD 組較 ADR 腎病組病理學損傷減輕，系膜基質指數(shù)降低和纖維化面積均明顯減少(均P<0.05)，足細胞融合減輕。由此，1,25-(OH)2D3能夠改善 ADR 引起的腎組織病理學和足細胞損傷。見表2,圖1。

2.4各組nephrin定位比較 Control 組 nephrin主要分布在腎小球,并沿腎小球毛細血管袢連續(xù)細線樣分布，在基底膜呈粗線樣排布；ADR 腎病組腎小球 nephrin 隨病程出現(xiàn)不連續(xù)分布；隨療程進展，ADR+VD 組不連續(xù)樣分布有所改善。見圖2。

表2 各組腎組織損傷指標比較

2.5各組nephrin 蛋白分布及陽性表達比較 Control 組腎小球毛細血管壁可見棕色和黃褐色顆粒團塊，連續(xù)粗線樣附著于足細胞，nephrin 在Control組高表達，ADR腎病組造模2、4、6、8、10 w nephrin表達明顯低于Control 組(均P<0.05)，ADR+VD組造模6、8、10 w nephrin 表達與ADR組比較，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，造模2～8 w與Control組比較，差異統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3，表3。

圖1 各組大鼠腎組織結構的改變(HE、Masson,×400；TEM,×4 000)

圖2 各組造模不同時間nephrin定位情況(IF，×400)

圖3 各組造模不同時間nephrin 蛋白表達(IHC,×400)

表3 各組造模不同時間nephrin 蛋白陽性表達比較

2.6各組nephrin 蛋白表達比較 與Control組比較，ADR腎病組nephrin蛋白表達顯著降低(均P<0.05)，ADR+VD組造模6、10 w nephrin 蛋白表達較ADR 腎病組顯著升高(均P<0.05)。見表4、圖4。

表4 各組造模不同時間nephrin 蛋白表達水平比較

1：Control組;2：ADR腎病組;3：ADR+VD組圖4 各組造模不同時間腎組織 nephrin 蛋白表達的比較

3 討 論

ADR 腎病是一種以初始足細胞損傷和蛋白尿及隨后的腎炎癥和纖維化為特征的模型，是目前模擬人類CKD較為完善且成熟的腎病模型〔5〕。1，25-(OH)2D3作為腎臟分泌的重要的內(nèi)分泌激素，在不同階段的CKD患者中存在不同程度的1，25-(OH)2D3水平的不足，早期補充1,25-(OH)2D3具有獨立于鈣磷調(diào)節(jié)之外的腎保護作用〔6，7〕。維生素 D 內(nèi)分泌系統(tǒng)在鈣平衡和骨代謝中承擔著重要的角色，多種生物學行為的調(diào)控，如誘導細胞的分化，抑制細胞的增殖和免疫調(diào)節(jié)等都需要維生素 D 水平的調(diào)控〔8〕。已有研究表明，維生素 D/維生素 D 類似物療法對CKD患者腎、心血管系統(tǒng)功能改善方面提供重要的支持〔9〕。

本研究證明了1,25-(OH)2D3顯著降低 ADR 引起的 BUN、Cre、腎指數(shù)升高和大量蛋白尿，并升高 Alb 水平，同時1,25-(OH)2D3還能夠改善 ADR 引起腎組織結構的損傷。此外，1，25-(OH)2D3已被證實具有抗炎、抑制系膜細胞增殖、降低蛋白尿和促纖維化細胞因子產(chǎn)生等多條途徑發(fā)揮重要的腎保護功能〔10〕。本研究表明，1,25-(OH)2D3不僅能有效降低 ADR 腎病大鼠尿蛋白的排泄及修復腎功能障礙，減輕腎組織病理損傷、還與改善足細胞的損傷密切相關。

足細胞(或內(nèi)臟上皮細胞)是排列在腎小球毛細血管外表面的終末分化細胞，是腎小球濾過柱的重要組成部分，足細胞損傷的嚴重程度和蛋白尿的產(chǎn)生密切相關，足細胞 SD 屏障的破壞是導致人體必需的血液蛋白、大分子和細胞進入尿液的原因〔11〕。足細胞是1，25-(OH)2D3發(fā)揮作用的重要靶點，足細胞的遺傳或后天損傷可能導致足突消退(足細胞融合或退縮)，這是蛋白尿性腎病的形態(tài)學特征。足細胞結構性損傷，如足突融合、脫落、SD斷裂等，是CKD進展為腎小球硬化和終末期腎衰竭的前兆指標〔12〕。足細胞功能的維持得益于其結構的完整性，其特征性標志物 nephrin-podocin-CD2AP 復合體附著于 SD 表面，維持足細胞的動態(tài)平衡和功能的調(diào)控。

本研究中，ADR 誘導的腎病模型大鼠腎小球內(nèi) nephrin 蛋白表達降低。nephrin是狹縫隔膜主要相關蛋白，在維持 SD 的完整性和信號傳輸中發(fā)揮重要作用，其紊亂或缺失是遺傳性和獲得性蛋白尿的主要原因〔13〕。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在實驗動物模型和伴有蛋白尿的人類獲得性腎病中 nephrin 表達降低，在一些 nephrin 基因敲除的實驗鼠中發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)嚴重的蛋白尿〔14,15〕。這些研究均表明，nephrin 表達缺失是蛋白尿發(fā)生發(fā)展的特征標志。本研究表明ADR 引起的腎組織結構破壞及大量蛋白尿的產(chǎn)生，依賴于 nephrin 蛋白表達水平的降低。雖然1,25-(OH)2D3在修復腎損傷和減少蛋白尿的過程中，與 nephrin 表達升高密切相關，但其具體的調(diào)節(jié)機制仍不明確，有待進一步研究。

綜上，1,25-(OH)2D3對 ADR 誘導的腎病具有一定的保護作用，表現(xiàn)為降低蛋白尿，改善腎功能，修復腎組織病理學損傷，此外，1,25-(OH)2D3的作用可能是通過促進 nephrin 蛋白的表達來維持腎小球濾過膜功能的完整性，從而降低蛋白尿。目前 CKD 的治療存在一定的局限性，隨著 CKD 在全球范圍內(nèi)的負擔加重，更好地了解腎臟損害的潛在機制具有重要的臨床意義，本研究結果可以為臨床CKD的治療提供一定的藥理基礎，有望作為一種有前景的替代療法用于CKD的治療。