金 輝, 王紅武

(同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092)

引 言

微生物能通過(guò)呼吸作用氧化有機(jī)物為自身供給能量，呼吸作用對(duì)于微生物的自身生長(zhǎng)以及環(huán)境中物質(zhì)的循環(huán)都有著十分重要的意義。經(jīng)典呼吸鏈理論認(rèn)為細(xì)胞膜是生物電子傳遞、能量代謝的主要場(chǎng)所。近年來(lái)，關(guān)于胞外電子傳遞的研究將經(jīng)典呼吸鏈從細(xì)胞內(nèi)延伸到了細(xì)胞外，基于此類呼吸鏈的能量代謝方式即為胞外呼吸[1]。胞外呼吸是指微生物在厭氧條件下在胞內(nèi)徹底氧化有機(jī)物并釋放電子，經(jīng)胞內(nèi)呼吸鏈傳遞到胞外電子受體使其還原并產(chǎn)生能量維持微生物自身生長(zhǎng)的過(guò)程[2]?？梢赃M(jìn)行胞外呼吸的微生物被稱為胞外呼吸菌，其廣泛分布于土壤、河流、海底沉積物中，可分為異化金屬還原菌、腐殖質(zhì)還原菌和產(chǎn)電菌3大類，多數(shù)為革蘭氏陰性菌，極少數(shù)為革蘭氏陽(yáng)性菌[3]。胞外電子傳遞最早是在20世紀(jì)80年代由Lovely等人提出的[4]，此后胞外電子傳遞受到了眾多科研工作者的關(guān)注，其作為一種新型的細(xì)胞呼吸方式，在廢水處理、環(huán)境修復(fù)、能量回收方面都有著較大的應(yīng)用前景，因此對(duì)其傳遞機(jī)理、影響因素和應(yīng)用前景的研究具有重要現(xiàn)實(shí)意義[5-6]。

1 胞外電子傳遞機(jī)理

微生物胞外電子傳遞主要包括兩個(gè)過(guò)程。第一個(gè)過(guò)程是電子產(chǎn)生后從內(nèi)膜經(jīng)過(guò)周質(zhì)傳遞到外膜，底物在微生物作用下發(fā)生氧化磷酸化，失去的電子通過(guò)胞內(nèi)的NADH脫氫酶、輔酶Q、泛醌等傳遞至細(xì)胞內(nèi)膜，再通過(guò)一系列細(xì)胞色素蛋白(Cytochrome，Cyt)或其它功能蛋白傳遞至細(xì)胞外膜[7]。細(xì)胞色素蛋白是一類以血紅素(heme)為輔基的電子傳遞蛋白的總稱，幾乎存在于所有的生物體內(nèi)。根據(jù)吸收光譜的不同，細(xì)胞色素可以分為a、b、c三類。第二個(gè)過(guò)程是電子從細(xì)胞外膜傳遞到最終電子受體，主要有直接接觸傳遞，納米導(dǎo)線傳遞機(jī)制、電子穿梭機(jī)制傳遞和應(yīng)電運(yùn)動(dòng)四種傳遞機(jī)制[8]。

1.1 電子由內(nèi)膜傳遞到外膜

不同產(chǎn)電菌將電子從內(nèi)膜傳遞到外膜的方式不同，但細(xì)胞色素蛋白尤其是細(xì)胞色素c都起著舉足輕重的作用。希瓦氏菌(ShewanellaoneidensisMR-1)和地桿菌(Geobactersulfurreducens)是目前對(duì)胞外電子傳遞機(jī)制研究最完善的兩種胞外呼吸菌。

S.oneidensisMR-1的電子傳遞機(jī)理如圖1所示，其細(xì)胞膜及周質(zhì)空間中分布著由多種細(xì)胞色素蛋白所構(gòu)建的電子傳遞網(wǎng)絡(luò)[9-10]。CymA氧化位于內(nèi)膜上的醌類中間體，并將釋放的電子傳遞至位于周質(zhì)中的細(xì)胞色素c。位于外膜上的MtrA、MtrB、MtrC和MtrC的同族蛋白OmcA形成跨外膜蛋白復(fù)合物Mtr途徑，將電子從周質(zhì)蛋白傳遞到細(xì)菌外膜表面。最后，由外膜細(xì)胞色素MtrC/OmcA完成對(duì)胞外電子受體的還原，即直接將電子傳遞到胞外電子受體上[11]。在這個(gè)過(guò)程中，CymA起著重要的樞紐作用，SirC和SirD組成的SirCD復(fù)合體可作為其替代物[12]。同樣的，MtrABC也存在相應(yīng)的同源物MtrFDE，這兩個(gè)Mtr同系物模塊具有相似的功能。其中，MtrA/D位于周質(zhì)蛋白中，不能與外膜蛋白直接接觸，MtrB/E起到了連接周質(zhì)和外膜的作用，MtrC/F和OmcA/SirCD按1∶2的比例形成蛋白復(fù)合體，可與胞外電子受體直接接觸并傳遞電子[13]。

圖1 希瓦氏菌(S.oneidensis MR-1)胞外電子傳遞示意圖Fig.1 Schematic diagram of S.oneidensis MR-1 extracellular electron transfer

Geobacter的胞外電子傳遞模式與S.oneidensisMR-1類似，但Geobacter內(nèi)各菌株內(nèi)具有更多的細(xì)胞色素c ，且種間差異較大，因而其傳遞模式更為復(fù)雜。G.sulfurreducens位于內(nèi)膜表面與細(xì)胞質(zhì)相連的MacA對(duì)于將電子傳遞至外膜蛋白至關(guān)重要，它可以從醌池中獲得電子[14]，并還原位于周質(zhì)中的三亞鐵血紅素PpcA[15]，并將電子傳遞至外膜蛋白的OMCs(包括OmcB、OmcE、OmcS及OmcZ)[16]。與S.oneidensisMR-1不同的是G.sulfurreducens必須通過(guò)導(dǎo)電菌毛將電子傳遞給胞外電子受體。S.oneidensisMR-1的Mtr金屬還原通道中的 MtrABC 蛋白復(fù)合體與G.sulfurreducens的孔蛋白-色素蛋白復(fù)合體沒(méi)有同源性，說(shuō)明它們相似的跨膜電子傳遞功能是通過(guò)獨(dú)立進(jìn)化而來(lái)的[17]。

1.2 電子從外膜傳遞到胞外電子受體

胞外呼吸的最終電子受體多為固體或大分子物質(zhì)，無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞膜，因此電子需要從細(xì)胞膜傳遞到最終電子受體，由于這個(gè)過(guò)程發(fā)生在細(xì)胞外，因此目前的研究多集中于此，其機(jī)理也較為清晰。電子由外膜到最終電子受體主要有以下4種機(jī)制：直接接觸機(jī)制、納米導(dǎo)線機(jī)制、電子穿梭機(jī)制以及應(yīng)電運(yùn)動(dòng)機(jī)制(如圖2)[8,17]。

圖2 4種胞外電子傳遞機(jī)制示意圖Fig.2 Schematic diagram of four kinds of extracellular electron transfer mechanism

直接接觸傳遞是指胞外呼吸菌與電子受體直接接觸，通過(guò)分布細(xì)胞膜外側(cè)的Cyt c將電子直接傳遞到胞外電子受體表面[18]，直接接觸傳遞是最直接的電子傳遞方式，但是該途徑需要胞外呼吸菌緊靠胞外電子受體，限制了其應(yīng)用且電子傳遞效率受到細(xì)菌濃度以及接觸面積的影響[19-20]。

納米導(dǎo)線最早是在2005年由Reguera等[21]提出的，他們發(fā)現(xiàn)胞外呼吸菌G.sulfurreducensDL1的菌毛具有導(dǎo)電性，并把這種生長(zhǎng)在細(xì)胞周圍的類似纖毛且具有導(dǎo)電性能的聚合蛋白微絲命名為“微生物納米導(dǎo)線”。在電子傳遞過(guò)程中，納米導(dǎo)線如同電子導(dǎo)管一樣，將細(xì)胞膜與電子受體連接起來(lái)。由于納米導(dǎo)線的存在，胞外呼吸菌可以在不接觸受體的情況下，實(shí)現(xiàn)電子遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移，并且大大提高電子傳遞效率[14,22]。

微生物可以利用外源介體(如環(huán)境中存在的腐殖質(zhì)、植物根系分泌物等)或內(nèi)生介體(自身分泌的代謝產(chǎn)物，如核黃素等)，將電子轉(zhuǎn)移至電子受體，這種通過(guò)中介體進(jìn)行胞外電子傳遞的方式即為電子穿梭機(jī)制，作為中介體的外源或內(nèi)生介體叫做電子穿梭體(electron shuttle，ES),也稱為氧化還原介體(redox mediate，RM)[23]。電子穿梭體是一種特殊的電子載體，可以可逆地參與氧化還原反應(yīng)。電子穿梭體可以穿過(guò)細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)被還原并將電子傳遞到胞外電子受體，在受體表面被氧化，如此循環(huán)往復(fù)，實(shí)現(xiàn)電子的跨膜轉(zhuǎn)移。

應(yīng)電運(yùn)動(dòng)機(jī)制是指某些胞外呼吸菌可以將產(chǎn)生的電子儲(chǔ)存在細(xì)胞膜表面，然后利用鞭毛運(yùn)動(dòng)撞擊受體表面，在撞擊瞬間釋放電子，完成電子轉(zhuǎn)移。在接觸釋放電子后，從胞外電子受體表面脫離，參與下一個(gè)循環(huán)[24]。

2 胞外電子傳遞的影響因素

胞外電子傳遞發(fā)展?jié)摿茫S著對(duì)其傳遞機(jī)理研究的不斷深入，人們開(kāi)始關(guān)注影響胞外電子傳遞效率的因素，以及可以促進(jìn)電子傳遞的措施。深入研究胞外電子傳遞機(jī)理以及促進(jìn)措施對(duì)胞外電子傳遞在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用有著十分重要的意義。

2.1 細(xì)胞色素c對(duì)胞外電子傳遞的影響

細(xì)胞色素c對(duì)胞外電子傳遞起到至關(guān)重要的作用。細(xì)胞色素c通常含有多個(gè)血紅素(heme)，電子可以在相鄰血紅素的鐵原子之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，使得細(xì)胞色素c可以傳遞電子[25]。理論計(jì)算發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素c中血紅素的距離和排列方式會(huì)影響電子傳遞的能力和效率[26]，因此，細(xì)胞色素c對(duì)電子的傳遞能力與其分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。韓蕊[9]對(duì)S.oneidensisMR-1野生型和各種突變體對(duì)水鐵礦的還原及生物礦化作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明MR-1主要通過(guò)胞外電子傳遞將水鐵礦還原呈Fe2+，并且敲除MtrA、CymA等關(guān)鍵系胞色素c后，MR-1的電子傳輸能力大幅降低，對(duì)水鐵礦的還原速率和轉(zhuǎn)化程度也降低，說(shuō)明MtrA、CymA是S.oneidensisMR-1胞外電子傳遞鏈的重要影響因素。丁德武[27]通過(guò)構(gòu)建基因組尺度的S.oneidensisMR-1細(xì)胞色素c網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素c網(wǎng)絡(luò)的獨(dú)特結(jié)構(gòu)可能衍生出S.oneidensisMR-1產(chǎn)生電力的能力，并且可以從該細(xì)胞色素c網(wǎng)絡(luò)中識(shí)別潛在的EET途徑。Li Hui等人[28]將含氧官能團(tuán)引入微生物燃料電池(Microbial fuel cells，MFCs)陽(yáng)極后發(fā)現(xiàn)該MFCs的最大電荷密度增加了27.7%，陽(yáng)極電阻則降低了21.8%，研究表明，含氧基團(tuán)的存在并沒(méi)有改變MFCs中的微生物群落，但其可以進(jìn)行胞外電子傳遞的電化學(xué)活性菌(Electrochemically Active Bacteria，EAB)細(xì)胞表面的細(xì)胞色素c比對(duì)照組增加了4倍，這說(shuō)明細(xì)胞色素c含量的增加可以增強(qiáng)EAB和電極之間的胞外電子轉(zhuǎn)移。

2.2 解偶聯(lián)劑對(duì)胞外電子傳遞的影響

胞外電子傳遞過(guò)程十分復(fù)雜，底物在氧化的過(guò)程中會(huì)在細(xì)胞質(zhì)膜兩側(cè)產(chǎn)生質(zhì)子推動(dòng)力(proton motive force，PMF)，為ADP磷酸化形成ATP提供能量。底物的氧化會(huì)生成大量電子和質(zhì)子，并在膜外側(cè)累積。在一定濃度范圍，利用解偶聯(lián)劑分離底物氧化過(guò)程和ATP合成過(guò)程，膜外側(cè)質(zhì)子的累積及產(chǎn)物抑制被破壞，包括S.oneidensisMR-1在內(nèi)的六種純種微生物胞外電子傳遞過(guò)程得到促進(jìn)[29]。

虞盛松[30]通過(guò)考察不同濃度的解偶聯(lián)劑3,3’,4’,5-四氯水楊酰苯胺(tetrachlorosalicylanilide, TCS)對(duì)Shewanella胞外電子傳遞的調(diào)控發(fā)現(xiàn)低濃度(50 g/L)的TCS可以在促進(jìn)MR-1對(duì)乳酸的消耗同時(shí)提高Shewanella的產(chǎn)電能力；而高濃度(400 g/L)的TCS會(huì)通過(guò)降低ATP合成酶的活性來(lái)抑制Shewanella的代謝和產(chǎn)電。這些結(jié)果表明，適當(dāng)添加解偶聯(lián)劑是一種簡(jiǎn)便的胞外電子傳遞調(diào)控手段。

2.3 鐵氧化物對(duì)胞外電子傳遞的影響

鐵氧化物表面與微生物胞外電子傳遞鏈上的細(xì)胞色素c之間的相互作用決定了鐵氧化物-微生物界面電子轉(zhuǎn)移的效率。理論計(jì)算結(jié)果表明胞外電子傳遞過(guò)程中不同蛋白之間的電子傳遞速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于外膜蛋白和鐵礦物界面的電子傳遞速率，因此微生物胞外電子傳遞的決速步驟是外膜蛋白與鐵礦物表面之間的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程[31]。磁鐵礦能夠促進(jìn)鐵還原微生物的胞外電子傳遞，在水田沉積物中加入磁鐵礦能在Geobacter富足的情況下加速電子傳遞到電極上的過(guò)程[32]。也有研究發(fā)現(xiàn)，磁鐵礦能夠取代Geobacter胞外電子傳遞過(guò)程中菌毛的作用，促進(jìn)地桿菌的長(zhǎng)距離電子傳遞[33]。納米磁鐵礦能像細(xì)胞色素c一樣附著在Geobacter的菌毛上，從而促進(jìn)胞外電子傳遞，且可以代替OmcS完成胞外電子傳遞[34]。近期天然赤鐵礦也被驗(yàn)證能夠有效參與并促進(jìn)微生物胞外電子傳遞[35]。

2.4 電子穿梭體對(duì)胞外電子傳遞的影響

在間接胞外電子傳遞過(guò)程中，微生物可以依靠自身分泌的內(nèi)生介體或外界介體作為電子穿梭體，完成電子的跨膜傳遞。外加電子穿梭體(如腐殖質(zhì)、黃素等)的存在對(duì)胞外電子傳遞具有促進(jìn)作用。在ShewanelladecolorationisS12和AeromonashydrophilaHS01還原針鐵礦(α-FeOOH)的過(guò)程中，添加AQC可使針鐵礦的還原速率提高3～4倍的[36-37]；在G.sulfurreducens還原水鐵礦的過(guò)程中，添加溶解態(tài)腐殖質(zhì)可使水鐵礦還原速率提升6倍[38]；在利用醌類物質(zhì)2-羥基-1，4-萘酯LQ還原Se(Ⅳ)、Te(Ⅳ)的過(guò)程中，腐殖質(zhì)類物質(zhì)的加入能夠有效增強(qiáng)二者的還原效果[39]；在Bacillussp.BT1還原Cr(Ⅵ) 的過(guò)程中，AQS的存在可以提高Cr(Ⅵ)的還原效率[40]；在利用S.oneidensisMR-1還原Fe(Ⅲ)氧化物的研究中，加入10μM/L的黃素類物質(zhì)，F(xiàn)e(Ⅲ)氧化物的還原速率可提供18倍[23]。

3 胞外電子傳遞的應(yīng)用

胞外電子傳遞由于其電子受體的存在于細(xì)胞外的這一特殊性，因而在污水處理、污染物轉(zhuǎn)化降解和生物能源的清潔生產(chǎn)中有著廣闊的應(yīng)用前景。

3.1 基于微生物燃料電池的應(yīng)用

微生物燃料電池(MFCs)，是以微生物為催化劑將可生物利用有機(jī)質(zhì)中化學(xué)能直接轉(zhuǎn)化為電能的燃料電池系統(tǒng)。MFCs以胞外電子傳遞鏈為基礎(chǔ)，利用胞外電極接收胞外呼吸菌產(chǎn)生的電子，轉(zhuǎn)化為電能。在MFCs中，微生物在陽(yáng)極催化氧化有機(jī)污染物并產(chǎn)生質(zhì)子和電子，質(zhì)子通過(guò)基質(zhì)和質(zhì)子交換膜(Proton exchange membrane ，PEM)傳遞到陰極，與氧氣和電子結(jié)合生成水；微生物通過(guò)呼吸作用產(chǎn)生的電子首先通過(guò)胞內(nèi)電子傳遞鏈傳遞到細(xì)胞膜，然后通過(guò)納米導(dǎo)線或電子穿梭體等直接或間接的方式傳遞到陽(yáng)極表面再通過(guò)外電路傳遞到陰極，在陰極與電子受體發(fā)生還原反應(yīng)，完成整個(gè)氧化還原反應(yīng)，同時(shí)電子不斷流過(guò)外電路而產(chǎn)生電能[41]MFC系統(tǒng)組成示意圖如圖3所示。自1991年MFCs第一次被用于處理污水，微生物燃料電池電池掀起了胞外電子傳遞的應(yīng)用熱潮，也是目前胞外電子傳遞研究最多，應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域[42]。

圖3 MFC示意圖Fig.3 Schematic diagram of microbial fuel cell

目前MFCs在微生物產(chǎn)電，易降解有機(jī)物、難降解有機(jī)物降解，生物脫氮、生物脫硫等領(lǐng)域有較多研究[41,43～47]。

廢水中含有大量的有機(jī)物，這些物質(zhì)可以作為碳源和電子供體被陽(yáng)極微生物利用，在去除污染物的同時(shí)還可以進(jìn)行能量回收。Li[48]利用單室空氣陰極MFC系統(tǒng)處理某食堂廢水，研究表明在進(jìn)水COD為2 700±20mg/L時(shí)，MFC的最大功率密度可達(dá)5.6W/m3，平均輸出電壓為0.51V，并且COD去除率可高達(dá)90.3%。Guo[49]利用雙室MFC處理煉油廢水時(shí)發(fā)現(xiàn)COD和含油量分別為450±50mg/L和50±5mg/L時(shí)，可分別去除64±4%的COD和84±3的含油量，此時(shí)MFC的最大功率密度為0.33 W/m3。Miran[45]處理某含銅量為20mg/L的廢水時(shí)發(fā)現(xiàn)，雙室MFC對(duì)Cu2+的還原效率可超過(guò)98%，同時(shí)TOC的去除率也可超過(guò)90%。

3.2 基于污染物降解的應(yīng)用

胞外電子傳遞也可應(yīng)用于環(huán)境修復(fù)，在降解有機(jī)污染物、氧化還原有毒有害重金屬污染物等方面起到了重要作用。微生物利用胞外電子傳遞降解污染物主要通過(guò)兩種機(jī)理：一是以有機(jī)污染物為電子供體，降解有機(jī)物；二是以污染物為電子受體，將有毒有害的的重金屬污染物轉(zhuǎn)化為低毒或無(wú)毒狀態(tài)[5]。

人類活動(dòng)產(chǎn)生了大量有機(jī)污染物，有機(jī)物電子供體的異化作用會(huì)把 O2作為電子受體而迅速消耗掉，從而形成厭氧環(huán)境，為 Fe(Ⅲ)氧化物作為電子受體參與有機(jī)物的氧化提供了主要場(chǎng)所，使得微生物通過(guò)胞外電子傳遞降解有機(jī)物成為可能。少數(shù)地桿菌可以在還原Fe(Ⅲ)氧化物的同時(shí)氧化芳香族化合物并降解一些微生物無(wú)法直接利用的共存污染物，這對(duì)修復(fù)芳烴污染的土壤有重大意義[50]。

以金屬為最終電子受體的金屬還原菌，可以還原污水中的有價(jià)金屬污染物，將有毒金屬污染物轉(zhuǎn)化為無(wú)毒或低毒物質(zhì)。此外對(duì)于Cr(Ⅵ)，Se(Ⅳ)，Se(Ⅵ)，Tc(Ⅶ)和U(Ⅵ)等以溶解態(tài)存在金屬元素，以及Cr(Ⅲ)，Se(0)，Tc(Ⅳ)和U(Ⅵ)等不溶態(tài)存在的金屬元素也可以利用金屬還原菌進(jìn)行修復(fù)[51]。如脫硫弧菌(Desulfovibriospp.)可以以H2為電子供體利用細(xì)胞色素c還原Cr(Ⅵ)[52]。在生物浸出方面，氧化亞硫桿菌在低品位的銅礦、金礦、鈾礦等領(lǐng)域取得了良好的浸出效果[53]。生物浸出同樣是利用胞外電子傳遞，將非溶解態(tài)有價(jià)金屬轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙鈶B(tài)離子，并加以回收，在礦產(chǎn)資源的回用中應(yīng)用廣泛。除了金屬離子污染物，鐵還原菌可以降解水中的有機(jī)污染物[54]。對(duì)于一些難降解有機(jī)污染物，如石油烴、多氯聯(lián)苯和硝基苯等污染物的去除效果也較好[55]。在生物脫鹽領(lǐng)域，以胞外電子傳遞為基礎(chǔ)的微生物脫鹽電池(Microbial desalination cell，MDC)，能夠利用產(chǎn)電菌去除溶液中的部分陰、陽(yáng)離子，從而起到較好的脫鹽效果[56]。

微生物胞外電子傳遞可以產(chǎn)生含胞外電子受體的納米材料，對(duì)Fe(Ⅲ)，Pd(Ⅱ)，Se(Ⅳ)，Se(Ⅵ)等的胞外還原可以形成含F(xiàn)e(Ⅱ)，Pd(0)，Se(0)等的納米材料。這些納米材料在催化，修復(fù)環(huán)境等方面都有著重要作用[4,57]。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

胞外呼吸豐富了微生物代謝的多樣性，在微生物燃料電池、污水處理、環(huán)境修復(fù)和納米材料合成等環(huán)境領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景，因此，微生物胞外電子傳遞的研究將受到持續(xù)的關(guān)注。目前主要針對(duì)兩種產(chǎn)電菌(S.oneidensis MR-1和G.sulfurreducens)開(kāi)展了電子從胞內(nèi)傳遞到細(xì)胞外膜的研究，對(duì)其他產(chǎn)電菌的研究很少；而隨著部分微生物胞外電子傳遞過(guò)程中至關(guān)重要的細(xì)胞色素蛋白得到確定，電子傳遞途徑逐漸清晰；人們已發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)控電子從外膜到胞外電子受體的過(guò)程可以影響電子傳遞的效率。但是，目前胞外電子傳遞的研究還有很大的局限性，大多數(shù)的研究針對(duì)單一菌種，如集中在S.oneidensis和G.sulfurreducens這兩種產(chǎn)電菌上，亟待對(duì)其他菌種以及混合菌群開(kāi)展研究，且胞外電子傳遞的分子學(xué)機(jī)制需要進(jìn)一步完善。此外，在研究傳遞機(jī)理的同時(shí)，也亟需開(kāi)展胞外電子傳遞的影響因素以及促進(jìn)措施的研究，以提高產(chǎn)電效率及處理污染物的效果等?！?/p>