姚 燦，張 倩，3， 張 霞，3，，楊 濤，李國友，王愛軍，武志強(qiáng)

（1.中國科學(xué)院成都生物研究所，四川成都 610041；2.河北古順釀酒股份有限公司，河北邢臺 054000；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

我國白酒釀造歷史悠久，蒸餾酒的生產(chǎn)可追溯到西漢時期[1]。神曲酒是我國的歷史名酒，唐代邢州神曲酒更是十分有名。北魏賈思勰的《齊民要術(shù)》中記載了一種“神曲”，其特色在于藥曲，即在酒曲制作過程中加入野蓼、桑葉、荷葉等中藥材。據(jù)《齊民要術(shù)》記載，“神曲”相較普通曲而言，具有發(fā)酵力強(qiáng)、發(fā)酵周期稍短的特點(diǎn)，即藥材中的活性成分會影響大曲微生物生態(tài)，使得大曲中的功能微生物發(fā)生變化。此外，藥材中的香味物質(zhì)也可能會轉(zhuǎn)移到酒體中，形成具有獨(dú)特風(fēng)味并含有健康功能因子的白酒。

大曲，素有“酒之骨”之稱，蘊(yùn)含豐富的微生物資源和酶系，是白酒釀造的驅(qū)動力，具有糖化、發(fā)酵、生香、呈味的作用[2]。近年來，研究人員利用高通量測序技術(shù)針對白酒大曲樣品進(jìn)行了一系列微生物群落結(jié)構(gòu)的研究，發(fā)現(xiàn)微生物的群落結(jié)構(gòu)分布與大曲品質(zhì)密切相關(guān)[3]。夏玙等[4]結(jié)合實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和二代測序技術(shù)，研究了熱風(fēng)干燥工藝對貯存期大曲中真菌群落的影響。趙金松等[5]采用非可培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計方法對大曲中的微生物群落和風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了相關(guān)性分析。徐占成等[6]運(yùn)用宏基因組學(xué)技術(shù)對劍南春大曲真菌群落組成進(jìn)行了深入研究。

為研究“神曲”與普通中高溫大曲之間微生物群落組成的差異，本試驗(yàn)以河北古順釀酒股份有限公司生產(chǎn)的普通中高溫大曲、“神曲”普通曲和“神曲”荷葉曲為研究對象，利用高通量測序技術(shù)對3類古順大曲進(jìn)行深入分析，為“神曲”運(yùn)用于白酒生產(chǎn)提供一定理論支撐和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

普通中高溫大曲、“神曲”普通曲（加入野蓼、桑葉2 種中藥材）和“神曲”荷葉曲（加入野蓼、桑葉、荷葉3 種中藥材）（皆由河北古順釀酒股份有限公司提供），DNA 提取試劑盒（ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit 1.3.0）和其他分子實(shí)驗(yàn)材料（由成都羅寧生物科技有限公司提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣本DNA提取

采用ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit 1.3.0對樣本的基因組DNA 進(jìn)行抽提后，利用瓊脂糖凝膠電泳對DNA純度進(jìn)行檢測，保存于-20 ℃冰箱。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

按指定測序區(qū)域，合成帶有Barcode 的特異引物分別對樣本的16S rDNA V4 區(qū)和ITS 2 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。

引物序列如下：

515F(5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3')；

806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')；

ITS3 KYO2(5'-GATGAAGAACGYAGYRAA-3')；

ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')；

PCR反應(yīng)體系見參考文獻(xiàn)[7]。

1.2.3 PCR產(chǎn)物定量

將樣本的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用膠回收試劑盒切膠回收PCR 產(chǎn)物，TE 緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA 片段。參照電泳檢測結(jié)果，將PCR 回收產(chǎn)物用Qubit 2.0（ThermoFisher 公司）進(jìn)行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

1.2.4 文庫構(gòu)建與測序

使用試劑盒TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit 進(jìn)行文庫構(gòu)建；采用PE250 測序方式，使用Hiseq Rapid SBS Kit v2 作為測序試劑盒、上機(jī)測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)過拼接、過濾得到可供后續(xù)分析的高質(zhì)量目標(biāo)序列。在97%相似性水平上進(jìn)行OTU（Operational Taxonomic Units）聚類并挑選出OTU的代表性序列，使用SILVA 數(shù)據(jù)庫確定物種分類信息，獲得細(xì)菌或真菌從門到屬水平下的種類及相對豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌群落組成分析

2.1.1 細(xì)菌門水平群落組成圖（圖1）

圖1 表明，在3 類大曲（普通曲（PT）、“神曲”普通曲（SP）、“神曲”荷葉曲（SH））中，厚壁菌門（Firmicutes）與放線菌門（Actinobacteria）相對豐度總和均超過98.5%，細(xì)菌中厚壁菌門占絕對優(yōu)勢，相對豐度皆超過97.1%。表明3 類大曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門水平上相似。

2.1.2 細(xì)菌屬水平群落組成圖（圖2）

從屬水平分類上，不同大曲中微生物的種類分析結(jié)果見圖2。3 類大曲中，魏斯氏菌屬（Weissella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和片球菌屬（Pediococcus）3 類微生物的相對豐度總和達(dá)到89.8%。魏斯氏菌屬和乳桿菌屬是3 類大曲中的優(yōu)勢物種，二者相對豐度總和超過83.4%。說明3 類古順大曲中的細(xì)菌皆以乳酸菌為主要微生物。除上述3類微生物之外，腸球菌屬（Enterococcus）、毛螺菌屬（Lachnospiraceae）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、鏈球菌屬（Streptococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、腎桿菌屬（Renibacterium）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）等相對豐度較低的微生物在3類大曲中也被檢測到。

2.2 真菌群落組成分析

2.2.1 真菌門水平群落組成圖（圖3）

基于真菌ITS 基因聚類分析，3 類大曲在門水平上的結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，子囊菌門（Ascomycota）與毛霉亞門（Mucoromycota）2類微生物是3類大曲中的優(yōu)勢微生物，二者相對豐度總和超過99.3%，其中子囊菌門占絕對優(yōu)勢，其相對豐度高達(dá)94.4%，在SH 中達(dá)到了96.3%；毛霉亞門的相對豐度則介于3.0%～4.9%之間。

2.2.2 真菌屬水平群落組成圖（圖4）

在屬水平上，3 類大曲的主要微生物結(jié)構(gòu)分布如圖4 所示。結(jié)果表明，熱子囊菌屬（Thermoascus）和曲霉屬（Aspergillus）是PT、SP 和SH 中的優(yōu)勢真菌，其相對豐度總和分別占比93.3%、84.9%、56.4%；在3類大曲樣品中，熱子囊菌屬的相對豐度范圍為30.8%～74.2%，SP 與SH 接近（30.8%、33.7%），最大值出現(xiàn)于PT樣品（74.2%）；曲霉屬的相對豐度范圍為19.1%～54.1%，PT 與SH 相接近（19.1%、22.7%），最大值出現(xiàn)在SP 樣品（54.1%）。根毛霉菌屬（Rhizomucor）在所有樣品中的相對豐度差異較?。ū３衷?.5%左右）。根據(jù)方差分析（ANOVA）結(jié)果，嗜熱真菌屬（Thermomyces）在3 類大曲中有顯著差異（p＜0.05），其在SH 樣品的相對豐度達(dá)到36.7%，而在PT 樣品中僅為0.3%，說明嗜熱真菌屬是SH樣品中的主要真菌群類。

3 結(jié)論

大曲是白酒釀造的糖化發(fā)酵菌劑，是決定白酒出酒率及口感風(fēng)味的關(guān)鍵所在，而大曲微生物又是決定大曲品質(zhì)的核心因素之一[8-9]。本研究利用高通量測序技術(shù)對古順3 類大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了深入分析。結(jié)果表明，3 類大曲中的細(xì)菌主要為厚壁菌門，并以乳酸菌群為優(yōu)勢菌，“神曲”中的原核微生物的物種多樣性及相對豐度與普通曲無顯著差異；真菌則以子囊菌門為主，其中熱子囊菌屬和曲霉屬是3 類大曲中共有的優(yōu)勢真菌，方差分析結(jié)果表明，嗜熱真菌屬在“神曲荷葉曲”中是主要真菌群類。譚崇堯等[10]對不同地域濃香型大曲微生物的分析結(jié)果中表明，長江中游和江淮地區(qū)的大曲中真菌主要為曲霉屬，北方派有酵母和嗜熱高溫菌（熱子囊菌屬和嗜熱真菌屬）為主要優(yōu)勢菌的差異。由此可見，在真菌群落結(jié)構(gòu)方面，古順普通曲與以嗜熱高溫菌為優(yōu)勢菌的北方派相似；“神曲普通曲”則接近于以曲霉屬為主的長江中游和江淮地區(qū)；而“神曲荷葉曲”（以熱子囊菌屬、曲霉屬和嗜熱真菌屬為主要真菌群類）則更接近于以嗜熱高溫菌為主要優(yōu)勢菌的北方派。